多重耐藥鮑曼不動桿菌對多粘菌素B的耐藥機制研究.pdf

1、目的：檢測臨床分離鮑曼不動桿菌中攜帶的β-內酰胺酶基因及外排泵基因，體外誘導鮑曼不動桿菌對多粘菌素B產生耐藥，以探討其對多粘菌素B的耐藥機制。
　　方法：1、連續(xù)收集西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床分離的63株非重復多重耐藥鮑曼不動桿菌，采用微量肉湯稀釋法測定亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、多粘菌素B及頭孢哌酮舒巴坦的最低抑菌濃度(MICs)。2、采用腸桿菌科基因間重復序列-聚合酶鏈反應(ERIC-

2、PCR)獲得63株鮑曼不動桿菌的指紋圖譜并進行同源性分析。3、采用聚合酶鏈反應(PCR)檢測β-內酰胺酶基因TEM、AmpC、OXA-23、KPC、IMP、VIM，外排泵基因adeB、adeG、adeJ、adeR、adeS，兩組份調節(jié)系統(tǒng)基因pmrA、pmrB。4、采用體外實驗對收集的菌株進行誘導耐藥，以獲得多粘菌素B耐藥的鮑曼不動桿菌。5、采用實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測誘導耐藥菌株及原始敏感菌株的外排泵基因

3、adeB、adeJ、adeG及兩組份調節(jié)系統(tǒng)基因pmrA、pmrB的mRNA表達情況，分析其表達差異。6、對負責脂質A生物合成的基因IpxA/lpxC/lpxD及兩組份調節(jié)系統(tǒng)基因pmrA、pmrB進行PCR擴增并將擴增產物測序，探討耐藥菌株是否發(fā)生特異性突變。7.采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)對誘導耐藥的菌株及原始敏感菌株進行檢測，分析其蛋白質差異。
　　結果：1、63株鮑曼不動桿菌對多粘菌素B

4、全部敏感，對亞胺培南、美羅培南、環(huán)丙沙星及阿米卡星的耐藥率為100％，對頭孢他啶的耐藥率為92％，對頭孢吡肟的耐藥率為97％，對頭孢哌酮舒巴坦的耐藥率為43％。2、63株鮑曼不動桿菌經(jīng)過ERIC-PCR檢測共分為5型，主要為A型58株（A1型26株，A2型32株）、B型2株，C、D、E各為1株，主要來自于ICU及呼吸內科。3、在臨床分離的63株鮑曼不動桿菌中，有50株產TEM型β-內酰胺酶，58株產AnpC酶，62株產OXA-23型碳青

5、霉烯酶，未發(fā)現(xiàn)產KPC、IMP、VIM的菌株。此外63株鮑曼不動桿菌中攜帶外排泵基因adeB、adeJ、adeG、adeR、adeS的分別為61、62、62、60、60株，攜帶pmrA、pmrB基因的分別為61及59株。4、對33株多粘菌素B敏感的鮑曼不動桿菌進行體外誘導耐藥試驗，共獲得了18株多粘菌素B耐藥的鮑曼不動桿菌，其對多粘菌素B的MIC值從0.5g/ml上升到256g/ml，而其他抗生素的MIC值均未發(fā)生明顯改變。5、通過RT

6、-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)誘導耐藥菌株與原始敏感菌株之間外排泵基因adeB、adeG、adeJ的mRNA表達量并無明顯差異（P值分別為0.586、0.983、0.948），兩組份調節(jié)系統(tǒng)基因PmrA在耐藥菌株存在高表達(p=0.014)，而PmrB基因在耐藥菌株與敏感菌株中表達無明顯差異(p=0.472)。6、對脂質A生物合成的基因lpxA/lpxC/lpxD測序發(fā)現(xiàn)，耐藥菌株的脂質A合成基因lpxC在2649454位堿基發(fā)生突變(GAA→AA

7、A)，導致編碼的谷氨酸變?yōu)橘嚢彼幔鴥山M份調節(jié)系統(tǒng)基因則未發(fā)現(xiàn)特異性突變。7、通過對多粘菌素B耐藥菌株及敏感菌株進行MALDI-TOF MS檢測分析發(fā)現(xiàn)，耐藥菌株在5177Da與6093Da出現(xiàn)特異的峰值增強現(xiàn)象，而在8049Da處則出現(xiàn)特異的峰值減弱。
　　結論：1、鮑曼不動桿菌對常用抗生素有較高的耐藥率，對于多粘菌素B則全部敏感。2、鮑曼不動桿菌對常用抗生素的耐藥與產生β-內酰胺酶及外排泵的表達有關。3、通過體外誘導的方法能夠