鮑曼不動(dòng)桿菌突變株中耐多粘菌素相關(guān)基因的定位與驗(yàn)證.pdf

1、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）是今年WHO剛剛公布的“耐藥性最強(qiáng)的TOP12”中的第一位，其對幾乎所有結(jié)構(gòu)類別的抗生素產(chǎn)生耐藥。多粘菌素被認(rèn)為是治療鮑曼不動(dòng)桿菌的“最后一道防線”，但多粘菌素治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染亦存在諸多問題。盡管臨床分離到的鮑曼不動(dòng)桿菌均表現(xiàn)為多粘菌素敏感型，但采用多粘菌素治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的失敗率高達(dá)35％，表明醫(yī)院內(nèi)的治療失敗與傳統(tǒng)的耐藥菌無關(guān)，可能與多粘菌素劑量不足引起細(xì)菌產(chǎn)生適

2、應(yīng)性耐藥相關(guān)。因此，我們猜測鮑曼不動(dòng)桿菌基因組可能存在“耐藥抑制基因”，在改變外在環(huán)境的情況下，“耐藥抑制基因”被“沉默”了，所以細(xì)菌變得耐藥。為了驗(yàn)證“耐藥抑制基因”這個(gè)想法，我們聯(lián)合mariner轉(zhuǎn)座和多粘菌素篩選到一些耐藥突變株，定位并證明“耐藥抑制基因”的存在，為后續(xù)耐藥機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)。
　　本研究以利用mariner轉(zhuǎn)座系統(tǒng)聯(lián)合多粘菌素構(gòu)建的耐多粘菌素的突變株為研究樣本，首先采用反向PCR技術(shù)定位出部分耐多粘菌素突變

3、株的mariner轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)，將被中斷的耐藥相關(guān)基因克隆入回補(bǔ)載體（pSUTetAB）中，然后將各自的回補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應(yīng)的突變株中，檢測突變株和回補(bǔ)突變株對多粘菌素的最低抑菌濃度（MIC）的變化，找出耐藥相關(guān)性較好的基因，采用RecETab重組系統(tǒng)定點(diǎn)敲除該基因，進(jìn)一步通過表型驗(yàn)證該基因位點(diǎn)與耐藥相關(guān)性。最后采用細(xì)菌雙雜交技術(shù)對該位點(diǎn)進(jìn)行耐藥機(jī)理的初步探索。
　　本研究成功采用反向PCR技術(shù)定位出耐多粘菌素突變株的6個(gè)轉(zhuǎn)座插入位