整合子和16S rRNA甲基化酶介導(dǎo)的多重耐藥不動桿菌機(jī)制研究.pdf

1、隨著抗生素的大量使用，近年來革蘭陰性桿菌在臨床分離率和耐藥率呈逐年上升趨勢，其中最主要為不動桿菌屬細(xì)菌和銅綠假單胞菌。不動桿菌屬細(xì)菌為條件致病菌，廣泛分布于水、土壤、醫(yī)院環(huán)境和人體皮膚表面。不動桿菌屬中以鮑曼不動桿菌最為常見，目前已成為繼大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌之后的重要臨床分離菌。多重耐藥不動桿菌已經(jīng)在世界各地出現(xiàn)，甚至暴發(fā)流行。因此，加強(qiáng)細(xì)菌耐藥監(jiān)測，研究多重耐藥分子機(jī)制是必須的。 本論文篩選出2007年8月

2、到2008年5月多重耐藥不動桿菌并進(jìn)行流行病學(xué)研究。通過研究多重耐藥不動桿菌中整合酶、整合子可變區(qū)基因，來分析整合子結(jié)構(gòu)確定整合子在不動桿菌多重耐藥中的作用。最后通過16S rRNA甲基化酶基因的擴(kuò)增分析我院多重耐藥不動桿菌對所有氨基糖苷類高水平耐藥的原因。 一、多重耐藥不動桿菌的耐藥性及菌株同源性研究 利用K—B紙片擴(kuò)散法從我院2007年7月-2008年5月臨床分離的不動桿菌中篩選出61株多重耐藥菌株，同時對三種不同類

3、抗生素耐藥的為多重耐藥菌株。 PCR擴(kuò)增OXA-51—like和16S rRNA-23S rRNA基因并且進(jìn)行基因序列分析將細(xì)菌鑒定到種。結(jié)果顯示61株多重耐藥不動桿菌中有55株鮑曼不動桿菌，3株3TU不動桿菌，1株13TU不動桿菌，1株醋酸鈣不動桿菌，1株溶血不動桿菌。 瓊脂稀釋法測定14種臨床常用抗菌藥物對多重耐藥不動桿菌的耐藥表型。MIC結(jié)果顯示多重耐藥不動桿菌對多粘菌素E耐藥率最低為9.7％，頭孢哌酮/舒巴坦耐

4、藥率為32.3％，米諾環(huán)素耐藥率16.1％，亞胺培南耐藥率為45.2％，對所有氨基糖苷類抗生素耐藥率高達(dá)90.0％以上。 脈沖場凝膠電泳對其進(jìn)行同源性分析。條帶分析發(fā)現(xiàn)這61株菌株分為5個克隆，其中A、B為主要克隆株，多重耐藥鮑曼不動桿菌在我院已經(jīng)出現(xiàn)大范圍傳播，需采取有效措施進(jìn)行干預(yù)。 二、不動桿菌整合子的結(jié)構(gòu)分析與耐藥相關(guān)性研究 設(shè)計整合酶基因特異性引物對61株多重耐藥不動桿菌中整合酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；利用

5、統(tǒng)計學(xué)軟件分析整合子陽性菌株與整合子陰性菌株對各臨床常用抗生素耐藥率之間的差異；以整合子陽性菌株為研究對象，用PCR擴(kuò)增和步移法測序測定整合子可變區(qū)基因盒，通過序列比對分析了解內(nèi)插耐藥基因盒的情況，分析整合子結(jié)構(gòu)。 結(jié)果顯示61株多重耐藥菌株中50株1類整合酶陽性(陽性率82％)，未檢測出2、3類整合酶；對1類整合子陽性和陰性菌株不動桿菌耐藥率分析發(fā)現(xiàn)，整合子陽性菌株對氨基糖苷類和喹諾酮類的耐藥率明顯高于整合子陰性菌株，(P＜0

6、.05)。對50株整合酶陽性菌株進(jìn)行可變區(qū)基因擴(kuò)增，27株出現(xiàn)1000-4000bp大小不等的片段，其中13株菌株攜帶aacA4、catB8、aadA1基因，9株菌株攜帶aacC1、ortX、orfX'、aadA1基因，4株菌株攜帶arr-3、aadA4基因，1株菌株攜帶dfrA12、orfF、aadA2基因，主要介導(dǎo)氨基糖苷類、氯霉素、利福平、磺胺的耐藥。 三、介導(dǎo)氨基糖苷類高水平耐藥的16S rRNA甲基化酶的研究