寵物源腸桿菌中16S rRNA甲基化酶基因的流行特征及其分子傳播機(jī)制研究.pdf

1、氨基糖苷類藥物是最早被發(fā)現(xiàn)并投入到臨床應(yīng)用中的抗生素之一，盡管其重要性曾一度由于一些副作用較少的廣譜抗菌藥的推出而有所削弱，時(shí)至今日，隨著多重耐藥細(xì)菌感染率的急劇升高，氨基糖甙類抗生素作為屈指可數(shù)的可用治療選擇之一，重新獲得了人們的廣泛關(guān)注。然而，也正因?yàn)榘被擒疹愃幬锏膹V泛應(yīng)用，近些年來，國內(nèi)外關(guān)于細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素耐藥情況日趨嚴(yán)重的報(bào)道日漸增多，可使細(xì)菌對其產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制種類眾多，其中以產(chǎn)生16S rRNA甲基化酶這種機(jī)制所導(dǎo)

2、致的耐藥程度最高（通常MIC＞512mg/L），它可介導(dǎo)對大多數(shù)的臨床重要氨基糖苷類，如阿貝卡星，慶大霉素，妥布霉素和阿米卡星等藥物的耐藥，并且可以通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動(dòng)元件在不同菌種和物種間進(jìn)行傳播。寵物作為人類最親密的伙伴，它們和人類健康的相互關(guān)聯(lián)性不言自明，本文旨在了解我國寵物臨床中16S rRNA甲基化酶基因流行性，進(jìn)一步研究其遺傳特征和傳播機(jī)制，為獸醫(yī)臨床上合理利用氨基糖苷類藥物并延緩其耐藥發(fā)展速度以及減小耐藥的程度

3、打下理論基礎(chǔ)，同時(shí)希望能以此為依據(jù)來促進(jìn)有效遏制寵物源16S rRNA甲基化酶基因向人類傳播的措施的制定，對解決由此引發(fā)的人類的公共衛(wèi)生問題起到一定的協(xié)助作用。
　　1、寵物源腸桿菌16S rRNA甲基化酶基因流行情況
　　本研究以從廣東省多個(gè)動(dòng)物醫(yī)院在2008、2009、2010、2012年間收集的381株腸桿菌（大腸桿菌343株，肺炎克雷伯菌30株，奇異變形桿菌6株，陰溝腸桿菌2株）為研究對象，用含有慶大霉素和阿米卡星的

4、藥板初步篩選出具有耐藥表型的菌株77株，通過PCR以及測序的方法檢測16S rRNA甲基化酶基因（armA，rmtA，rmtB，rmtC，rmtD，rmtE，rmtF，rmtG和 npmA），分析不同分離時(shí)間腸桿菌的耐藥狀況以及16S rRNA甲基化酶基因的流行情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在381株受試腸桿菌中，61(16.01％，61/381)株攜帶有rmtB基因,4（1.05%，4/381）株攜帶armA基因，2（0.52%,2/381）株同時(shí)

5、攜帶rmtB、armA兩種基因，未檢出其它16S rRNA甲基化酶基因。
　　采用瓊脂二倍稀釋法檢測了77株對阿米卡星和慶大霉素有耐藥表型的菌株對獸醫(yī)臨床常用幾類抗菌藥物：氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、酰胺醇類、四環(huán)素類和磺胺類的14種抗菌藥的敏感性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，這些腸桿菌對四環(huán)素、慶大霉素、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、氨芐西林、卡那霉素耐藥率達(dá)90%以上，對頭孢噻肟、諾氟沙星、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、氯霉素、鏈霉素、阿米卡星、新霉

6、素的耐藥率在50%~90%之間；對安普霉素耐藥的細(xì)菌比重則低于50%。耐藥率最高的前五種抗生素分別是四環(huán)素（98.70%）、氨芐西林（97.40%）、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶（96.10%）、慶大霉素（94.81%）和卡那霉素（94.81%）。77株腸桿菌產(chǎn)生耐藥率最低的三種藥物分別是安普霉素（41.56%）、氟苯尼考（53.25%）和頭孢噻肟（55.84%）。對剩下的6種抗菌藥物耐藥率范圍在70.13%至89.61%之間。這些數(shù)據(jù)充分說明

7、，寵物源產(chǎn)16S rRNA甲基化酶的腸桿菌多重耐藥情況十分嚴(yán)重。
　　2、16S rRNA甲基化酶基因的傳播機(jī)制
　　運(yùn)用脈沖場凝膠電泳（pulsedfield gel electrophoresis，PFGE）、接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)、接合子質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析（RFLP）以及S1-PFGE和Southern blot等方法從垂直傳播和水平傳播兩方面來研究16S rRNA甲基化酶基因的傳播機(jī)制。PFGE結(jié)果表明16S

8、rRNA甲基化酶陽性大腸桿菌之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而分離自同一寵物醫(yī)院的肺炎克雷伯菌株的PFGE分型相似則提示存在菌株克隆傳播現(xiàn)象。通過接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證明了16S rRNA甲基化酶基因的可轉(zhuǎn)移性，且在部分菌株中blaCTX-M能隨rmtB一同轉(zhuǎn)移到受體菌中。在大腸桿菌中，rmtB位于60kb~194kb左右的大小不同的IncF33或IncF2型質(zhì)粒上，在肺炎克雷伯菌中，rmtB均位于~97kb的IncF33的質(zhì)粒上。對接合子質(zhì)粒進(jìn)行EcoR

9、I酶切，發(fā)現(xiàn)部分具有相同復(fù)制子分型的質(zhì)粒酶切條帶相同或相似，有的酶切譜型相似的質(zhì)粒分別來自大腸桿菌和肺炎克雷伯菌，說明攜帶16S rRNA甲基化酶基因的質(zhì)?？赡艽嬖诰N間的傳播，而IncF型質(zhì)粒是促進(jìn)16S rRNA甲基化酶耐藥基因在寵物源菌株間水平傳播、快速擴(kuò)散的主要載體。
　　在廣州寵物源腸桿菌中，16S rRNA甲基化酶基因的存在比較普遍，且以rmtB基因型為主，armA基因型偶發(fā)。本研究中的大腸桿菌16S rRNA甲基化酶

10、陽性菌中rmtB基因位于~60kb至~194kb的IncF型接合性質(zhì)粒上，且存在部分的質(zhì)粒在菌種間傳播的現(xiàn)象；垂直克隆傳播和水平傳播共同造成了16S rRNA甲基化酶基因在肺炎克雷伯菌中的流行。rmtB陽性菌中廣泛存在CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，并能與rmtB基因一起進(jìn)行接合傳播，介導(dǎo)細(xì)菌同時(shí)對氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性?，F(xiàn)如今，寵物社會(huì)地位的提高使得人類和他們的寵物之間有了更頻繁而密切的身體接觸（例如，通過共享生活空間）