臨床分離黏質(zhì)沙雷菌質(zhì)粒編碼的16S rRNA甲基化酶基因與β-內(nèi)酰胺酶基因的研究.pdf

1、目的：
　　了解201株安徽地區(qū)臨床分離黏質(zhì)沙雷菌藥敏情況和質(zhì)粒介導(dǎo)的16S rRNA甲基化酶檢出率與基因型，為臨床合理選擇抗菌藥物提供依據(jù)。
　　研究臨床分離黏質(zhì)沙雷菌質(zhì)粒介導(dǎo)的16S rRNA甲基化酶耐藥基因與β-內(nèi)酰胺酶基因的共轉(zhuǎn)移情況。
　　材料與方法：
　　菌株來(lái)源：
　　201株黏質(zhì)沙雷臨床分離菌株，來(lái)源于安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中心監(jiān)測(cè)網(wǎng)所屬34所醫(yī)院(由皖南、皖中、皖北不同級(jí)別的醫(yī)院組成)2005

2、年~2012年每年9月份住院和門(mén)診患者的各類(lèi)臨床標(biāo)本。藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922，轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)受體菌大腸埃希菌J53 AZR，二者均為安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)控中心保存。
　　方法：
　　1.采用MH瓊脂倍比稀釋法測(cè)定臨床分離黏質(zhì)沙雷菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性，質(zhì)控菌采用E.coli ATCC25922。
　　2.煮沸法提取細(xì)菌的總 DNA，堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA；用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增質(zhì)粒介導(dǎo)16S

3、 rRNA甲基化酶基因；PCR產(chǎn)物純化測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中經(jīng)Blast程序比對(duì)分析，以明確16S rRNA甲基化酶基因的基因型別以及是否突變。
　　3.用16S rRNA甲基化酶基因陽(yáng)性菌株與大腸埃希菌J53AzR行轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)；對(duì)接合子進(jìn)行生化鑒定并經(jīng)PCR檢測(cè)耐藥基因，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA測(cè)序確認(rèn)；采用Muller-Hinton瓊脂對(duì)比稀釋法測(cè)定大腸埃希菌J53AzR與接合子對(duì)抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)。

4、r>　　4.以16S rRNA甲基化酶基因陽(yáng)性臨床分離菌株的總DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺酶基因；PCR產(chǎn)物純化測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中經(jīng)Blast程序比對(duì)，比較分析16S rRNA甲基化酶基因型別與β-內(nèi)酰胺酶基因型別關(guān)系。
　　5.以16S rRNA甲基化酶基因陽(yáng)性接合子菌株質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺酶基因；PCR產(chǎn)物純化測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中經(jīng)Blast程序比對(duì)，明確基因型。探究1

5、6S rRNA甲基化酶基因與β-內(nèi)酰胺酶基因是否共轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)果：
　　1.201株黏質(zhì)沙雷菌中，對(duì)17種抗菌藥物的敏感率及耐藥率可以看出，黏質(zhì)沙雷菌對(duì)亞胺培南和美羅培南最敏感，敏感率高達(dá)98.51％。相比于其他三代頭孢類(lèi)抗菌藥物，酶抑制劑復(fù)合制劑如哌拉西林-他唑巴坦和頭孢哌酮-舒巴坦以及四代頭孢菌素頭孢吡肟的敏感性較好，分別可達(dá)76.62%、65.63%及74.13%。喹諾酮類(lèi)抗菌藥以加替沙星抗菌藥物敏感性最高，為77.

6、11%，其次為左氧氟沙星敏感性達(dá)75.12%。本研究中檢測(cè)出135株對(duì)慶大霉素耐藥、58株對(duì)阿米卡星耐藥，二者耐藥率分別為：67.16%及28.8%，58株對(duì)阿米卡星耐藥的菌株同時(shí)對(duì)慶大霉素耐藥。58株阿米卡星耐藥菌株中45株來(lái)自痰，5株來(lái)自尿液，3株來(lái)自血液，3株來(lái)自分泌物，1株來(lái)自胸水，1株來(lái)自大便。
　　2.58株同時(shí)對(duì)阿米卡星和慶大霉素耐藥的黏質(zhì)沙雷菌經(jīng)PCR檢測(cè)和DNA測(cè)序，7株為16S rRNA甲基化酶基因陽(yáng)性，其中5

7、株為armA陽(yáng)性，2株為rmtB陽(yáng)性，所有菌株rmtA、rmtC、rmtD和npmA基因檢測(cè)均為陰性。16S rRNA甲基化酶基因陽(yáng)性菌株數(shù)占總臨床分離黏質(zhì)沙雷菌株數(shù)的陽(yáng)性率為3.5％(7/201)，在耐阿米卡星菌株中的陽(yáng)性率為12.1％(7/58)。
　　3.7株16S rRNA甲基化酶基因陽(yáng)性的菌株中有6株轉(zhuǎn)移接合成功，接合子經(jīng)生化鑒定為大腸埃希菌。經(jīng)PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序分析證實(shí)，5株接合子攜帶armA基因；1株接合子攜帶r

8、mtB基因。藥敏結(jié)果表明，這6株接合子與受體菌相比，對(duì)阿米卡星等五種氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥性明顯提高。接合子對(duì)第四代頭孢菌素以及碳青霉烯類(lèi)均敏感。
　　4.7株16S rRNA甲基化酶基因陽(yáng)性的菌株經(jīng)PCR檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶基因顯示5株臨床分離株檢測(cè)出β-內(nèi)酰胺酶基因，最常見(jiàn)的基因型別為CTX-M。且PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA測(cè)序表明4株CTX-M基因陽(yáng)性，均為CTX-M-14型；2株TEM基因陽(yáng)性，均為T(mén)EM-1型；2株OXA基因陽(yáng)性，均為

9、OXA-1型；1株SHV基因陽(yáng)性，為SHV-5型。其中有3株菌株檢測(cè)出二種以上β-內(nèi)酰胺酶基因。
　　5.對(duì)6株攜帶有16S rRNA甲基化酶基因的轉(zhuǎn)移接合成功接合子，以質(zhì)粒DNA為模板，經(jīng)PCR檢測(cè)出4株β-內(nèi)酰胺酶基因，其PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)：3株CTX-M基因陽(yáng)性，均為CTX-M-14型；2株TEM基因陽(yáng)性，均為T(mén)EM-1型；1株SHV基因陽(yáng)性，為SHV-5型。
　　結(jié)論：
　　1.藥敏結(jié)果顯示安徽地區(qū)臨床

10、分離黏質(zhì)沙雷菌對(duì)多種抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度耐藥，耐氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物的菌株呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。
　　2.研究報(bào)道了安徽地區(qū)存在攜帶有質(zhì)粒編碼的16S rRNA甲基化酶耐藥基因的黏質(zhì)沙雷菌，也是國(guó)內(nèi)第一次在黏質(zhì)沙雷菌中檢出16S rRNA甲基化酶基因。
　　3.轉(zhuǎn)移接合實(shí)驗(yàn)成功的接合子對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物的MIC較受體菌相比，對(duì)阿米卡星等五種氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥性明顯提高。
　　4.我國(guó)黏質(zhì)沙雷菌中已經(jīng)出現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的16S