臨床分離黏質(zhì)沙雷菌質(zhì)粒編碼的16S rRNA甲基化酶基因與β-內(nèi)酰胺酶基因的研究.pdf

1、目的：
　　了解201株安徽地區(qū)臨床分離黏質(zhì)沙雷菌藥敏情況和質(zhì)粒介導(dǎo)的16S rRNA甲基化酶檢出率與基因型，為臨床合理選擇抗菌藥物提供依據(jù)。
　　研究臨床分離黏質(zhì)沙雷菌質(zhì)粒介導(dǎo)的16S rRNA甲基化酶耐藥基因與β-內(nèi)酰胺酶基因的共轉(zhuǎn)移情況。
　　材料與方法：
　　菌株來源：
　　201株黏質(zhì)沙雷臨床分離菌株，來源于安徽省細菌耐藥監(jiān)測中心監(jiān)測網(wǎng)所屬34所醫(yī)院(由皖南、皖中、皖北不同級別的醫(yī)院組成)2005

2、年~2012年每年9月份住院和門診患者的各類臨床標(biāo)本。藥敏實驗質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922，轉(zhuǎn)移接合試驗受體菌大腸埃希菌J53 AZR，二者均為安徽省細菌耐藥監(jiān)控中心保存。
　　方法：
　　1.采用MH瓊脂倍比稀釋法測定臨床分離黏質(zhì)沙雷菌株對抗菌藥物的敏感性，質(zhì)控菌采用E.coli ATCC25922。
　　2.煮沸法提取細菌的總 DNA，堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA；用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴增質(zhì)粒介導(dǎo)16S

3、 rRNA甲基化酶基因；PCR產(chǎn)物純化測序，測序結(jié)果在GenBank中經(jīng)Blast程序比對分析，以明確16S rRNA甲基化酶基因的基因型別以及是否突變。
　　3.用16S rRNA甲基化酶基因陽性菌株與大腸埃希菌J53AzR行轉(zhuǎn)移接合試驗；對接合子進行生化鑒定并經(jīng)PCR檢測耐藥基因，PCR擴增產(chǎn)物DNA測序確認；采用Muller-Hinton瓊脂對比稀釋法測定大腸埃希菌J53AzR與接合子對抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)。

4、r>　　4.以16S rRNA甲基化酶基因陽性臨床分離菌株的總DNA為模板，采用PCR方法擴增β-內(nèi)酰胺酶基因；PCR產(chǎn)物純化測序，測序結(jié)果在GenBank中經(jīng)Blast程序比對，比較分析16S rRNA甲基化酶基因型別與β-內(nèi)酰胺酶基因型別關(guān)系。
　　5.以16S rRNA甲基化酶基因陽性接合子菌株質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴增β-內(nèi)酰胺酶基因；PCR產(chǎn)物純化測序，測序結(jié)果在GenBank中經(jīng)Blast程序比對，明確基因型。探究1

5、6S rRNA甲基化酶基因與β-內(nèi)酰胺酶基因是否共轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)果：
　　1.201株黏質(zhì)沙雷菌中，對17種抗菌藥物的敏感率及耐藥率可以看出，黏質(zhì)沙雷菌對亞胺培南和美羅培南最敏感，敏感率高達98.51％。相比于其他三代頭孢類抗菌藥物，酶抑制劑復(fù)合制劑如哌拉西林-他唑巴坦和頭孢哌酮-舒巴坦以及四代頭孢菌素頭孢吡肟的敏感性較好，分別可達76.62%、65.63%及74.13%。喹諾酮類抗菌藥以加替沙星抗菌藥物敏感性最高，為77.

6、11%，其次為左氧氟沙星敏感性達75.12%。本研究中檢測出135株對慶大霉素耐藥、58株對阿米卡星耐藥，二者耐藥率分別為：67.16%及28.8%，58株對阿米卡星耐藥的菌株同時對慶大霉素耐藥。58株阿米卡星耐藥菌株中45株來自痰，5株來自尿液，3株來自血液，3株來自分泌物，1株來自胸水，1株來自大便。
　　2.58株同時對阿米卡星和慶大霉素耐藥的黏質(zhì)沙雷菌經(jīng)PCR檢測和DNA測序，7株為16S rRNA甲基化酶基因陽性，其中5

7、株為armA陽性，2株為rmtB陽性，所有菌株rmtA、rmtC、rmtD和npmA基因檢測均為陰性。16S rRNA甲基化酶基因陽性菌株數(shù)占總臨床分離黏質(zhì)沙雷菌株數(shù)的陽性率為3.5％(7/201)，在耐阿米卡星菌株中的陽性率為12.1％(7/58)。
　　3.7株16S rRNA甲基化酶基因陽性的菌株中有6株轉(zhuǎn)移接合成功，接合子經(jīng)生化鑒定為大腸埃希菌。經(jīng)PCR擴增及DNA測序分析證實，5株接合子攜帶armA基因；1株接合子攜帶r

8、mtB基因。藥敏結(jié)果表明，這6株接合子與受體菌相比，對阿米卡星等五種氨基糖苷類抗生素耐藥性明顯提高。接合子對第四代頭孢菌素以及碳青霉烯類均敏感。
　　4.7株16S rRNA甲基化酶基因陽性的菌株經(jīng)PCR檢測β-內(nèi)酰胺酶基因顯示5株臨床分離株檢測出β-內(nèi)酰胺酶基因，最常見的基因型別為CTX-M。且PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA測序表明4株CTX-M基因陽性，均為CTX-M-14型；2株TEM基因陽性，均為TEM-1型；2株OXA基因陽性，均為

9、OXA-1型；1株SHV基因陽性，為SHV-5型。其中有3株菌株檢測出二種以上β-內(nèi)酰胺酶基因。
　　5.對6株攜帶有16S rRNA甲基化酶基因的轉(zhuǎn)移接合成功接合子，以質(zhì)粒DNA為模板，經(jīng)PCR檢測出4株β-內(nèi)酰胺酶基因，其PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA測序證實：3株CTX-M基因陽性，均為CTX-M-14型；2株TEM基因陽性，均為TEM-1型；1株SHV基因陽性，為SHV-5型。
　　結(jié)論：
　　1.藥敏結(jié)果顯示安徽地區(qū)臨床

10、分離黏質(zhì)沙雷菌對多種抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度耐藥，耐氨基糖苷類抗菌藥物的菌株呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。
　　2.研究報道了安徽地區(qū)存在攜帶有質(zhì)粒編碼的16S rRNA甲基化酶耐藥基因的黏質(zhì)沙雷菌，也是國內(nèi)第一次在黏質(zhì)沙雷菌中檢出16S rRNA甲基化酶基因。
　　3.轉(zhuǎn)移接合實驗成功的接合子對氨基糖苷類抗菌藥物的MIC較受體菌相比，對阿米卡星等五種氨基糖苷類抗生素耐藥性明顯提高。
　　4.我國黏質(zhì)沙雷菌中已經(jīng)出現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的16S