臨床分離大腸埃希菌中稀有β-內(nèi)酰胺酶基因的克隆和分子特征研究.pdf

1、目的：
　　研究臨床分離大腸埃希菌中稀有β-內(nèi)酰胺酶基因的識別及其耐藥特性、基因定位和陽性菌株的流行病學(xué)調(diào)查，為有效防治β-內(nèi)酰胺酶基因耐藥性的形成和播散提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和抗菌藥物的合理使用提供指導(dǎo)。
　　方法：
　　1.以2009年-2011年間溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離的大腸埃希菌為研究樣本，采用SDS法提取細(xì)菌基因組DNA，送交中科院北京基因組研究所進(jìn)行solexa測序。
　　2.將樣本測序所得到的短序列

2、進(jìn)行拼接和注釋，從GenBank數(shù)據(jù)庫和ARDB中收集到的β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因作為參考序列，對測序讀長進(jìn)行mapping，得到各基因在大腸埃希菌測序序列中的豐度。
　　3.選取4個(gè)稀有β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因，設(shè)計(jì)特異性引物通過PCR方法來檢測499株大腸埃希菌中4個(gè)稀有β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的分布情況，PCR產(chǎn)物測序確定陽性菌株。
　　4.對篩選的陽性大腸埃希菌菌株進(jìn)行體外敏感性試驗(yàn)來判斷耐藥性。
　　5.將陽性基因擴(kuò)增進(jìn)

3、行分子克隆及克隆菌株體外敏感性試驗(yàn)判斷4個(gè)稀有β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因ORF的耐藥特性。
　　6.根據(jù)克隆菌株ORF測序序列進(jìn)行BLAST比對和MEGA6.06軟件分析不同的SNPs導(dǎo)致的氨基酸變異。
　　7.利用攜帶稀有β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的陽性菌株與受體菌EC600的接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)來研究基因及其質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移能力，對陽性接合子進(jìn)行PCR驗(yàn)證稀有β-內(nèi)酰胺酶基因，并檢測陽性接合子的體外藥敏情況。
　　8.利用特異性探針進(jìn)行

4、Southern blot來確定稀有β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因存在于質(zhì)粒上還是非質(zhì)粒上（染色體上）的定位分析。
　　9.利用脈沖場凝膠電泳(PFGE)進(jìn)行稀有β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因陽性大腸埃希菌菌株間的同源性分析來研究耐藥菌株的流行特征。
　　結(jié)果：
　　1.從β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因豐度圖中可以看出在大腸埃希菌中存在不同程度的β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因，其中blaTEM、blaOXA、blaCT X-M-9和blaCT X-M-1這四

5、個(gè)基因型的平均豐度很高，而blaDHA、blaSHV, blaBIL和blaKLUC平均豐度很低，大都已經(jīng)被報(bào)道過并也存在于大腸埃希菌中，但是報(bào)道的數(shù)量不多。
　　2.篩選共有21株陽性大腸埃希菌:單株攜帶單個(gè)blaKLUC、 blaBIL、blaDHA和blaSHV分別有5株、8株、4株和2株;共同攜帶blaKLUC和blaSHV有1株，共同攜帶blaDHA和blaSHV有2株。21株對β-內(nèi)酰胺類有不同程度的耐藥，其中對廣譜青

6、霉素類（氨芐西林-81％、哌拉西林-66.7％）和第三代頭孢菌素（頭孢唑啉-81％、頭孢他啶-81％和頭孢曲松-66.7％）較高的耐藥率。
　　3.共得到20株ORF克隆菌株（其中4株blaKLUC,8株blaBIL（blaCMY）、4株blaDHA和4株blaSHV克隆菌株）并進(jìn)行體外藥敏性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各基因ORF有著不同的耐藥特性，其中有1株blaKLUC、4株blaBIL和4株blaDHA都無抗性，剩余11株克隆菌株都有抗性，

7、這是由于氨基酸位點(diǎn)的不同導(dǎo)致了藥物的抗性不同。并發(fā)現(xiàn)了1株新亞型blaKLUC、5株新亞型blaCMY、4株新亞型blaDHA、1株新亞型blaSHV。
　　4.接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)成功得到了1株攜帶blaKLUC的接合子J-D2716、3株各自攜帶blaCMY的接合子J-D2308、J-D2382、J-D2735以及1株都共同攜帶bla SHV-5和blaDHA的接合子J-D2485和1株共同攜帶blaSHV-5和blaDHA的D248

8、7只檢測出攜帶blaSHV-5的接合子J-D2487。
　　5.將21株陽性野生菌株和6株接合子進(jìn)行Southern blot，其結(jié)果與接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，除了一株D2417陽性野生菌攜帶的新亞型blaCMY的Southern blot結(jié)果陽性，但未能接合轉(zhuǎn)移成功，說明該6株接合子攜帶的各自稀有β-內(nèi)酰胺酶基因位于各自約23kb大小的可轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒上，而D2417攜帶的新亞型blaCMY坐落在不可轉(zhuǎn)移的23kb的質(zhì)粒上，其它剩余的

9、可能位于各自菌株的染色體上。
　　6.在21株陽性稀有β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的大腸埃希菌中，有17個(gè)PFGE型，有3個(gè)無PFGE。其中只有共同攜帶不同新型基因型blaDHA和相同blaSHV-5的兩株2010年菌株D2485和D2487為同一個(gè)PFGE型，即相同克隆型，表明此兩株菌株在2010年存在小范圍的克隆播散，而其它菌株都為不同的PFGE型，表明稀有β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的大腸埃希菌總體上不是由于克隆播散引起的。
　　結(jié)論

10、：
　　1.大腸埃希菌中稀有β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的低陽性檢出率與高通量測序技術(shù)以及生物信息學(xué)技術(shù)得到的豐度圖結(jié)果較為一致，這使我們能夠在短時(shí)間內(nèi)利用核酸序列，來探索基因結(jié)構(gòu)與病原菌耐藥性的關(guān)系，對于致病菌中耐藥基因的分布及新基因的發(fā)掘和功能研究起著極為有效的作用，為新藥的研制與開發(fā)提供了新的思路。
　　2.碳青霉烯類藥物可用于臨床大腸埃希菌感染性疾病的治療。
　　3.在21株陽性稀有β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的大腸埃希菌中，

11、有17個(gè)PFGE型，有3個(gè)無PFGE。只有2010年的兩株菌株D2485和D2487為同一個(gè)PFGE型，說明此兩株菌株在2010年存在小范圍的克隆播散，而三年間稀有β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的大腸埃希菌總體上不是由于克隆播散引起的，且也體現(xiàn)了遺傳背景的多樣性。
　　4.發(fā)現(xiàn)較多的新型基因型，進(jìn)一步證明了高通量測序以及生物信息學(xué)技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)一些與已知基因同源性很高的新型耐藥基因型。
　　5.接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)和Southern blot實(shí)

12、驗(yàn)共同揭示了基因的定位與質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性。
　　6.blaSHV-5 ORF是這些基因中對β-內(nèi)酰胺類抗生素具有最多的多種藥物耐藥的基因型，Gly238Ser和Glu240Lys突變對氨芐西林、哌拉西林、阿莫西林、頭孢噻肟和氨曲南耐藥，blaSHV中Ser133Gly新位點(diǎn)只對氨芐西林、哌拉西林、阿莫西林耐藥;blaCMY(blaBIL)Va1231Ser、Asp301Gly兩個(gè)新位點(diǎn)突變對氨芐西林由耐藥變成了敏感，對頭孢唑啉由中度