雞源分離菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分型和整合子分子特征.pdf

1、隨著抗菌藥長(zhǎng)期廣泛使用，腸桿菌科雞源分離菌對(duì)藥物的耐藥率逐年升高，且呈多重耐藥趨勢(shì)。導(dǎo)致細(xì)菌獲得多重耐藥的因素有很多，其中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrumβ-lactamases，ESBLs)和整合子被證實(shí)常參與細(xì)菌多重耐約的形成。為此，做了以下研究：
　　 （一）利用VITEK-32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對(duì)從河南省14個(gè)地市不同養(yǎng)雞場(chǎng)分離的64株雞源分離菌進(jìn)行鑒定，獲得51株雞源大腸桿菌、8株雞源沙門菌、4株雞

2、源奇異變形桿菌和1株雞源鮑曼不動(dòng)桿菌，其中雞源鮑曼不動(dòng)桿菌為國(guó)內(nèi)外首次分離。采用微量稀釋法測(cè)定64株雞分離菌對(duì)p-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類、氟喹諾酮類和磺胺等六類共24個(gè)藥物或組合的多重耐藥表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)58.8％～74.5％的雞源大腸桿菌對(duì)三代頭孢耐藥，96％(49/51)為四重及以上耐藥菌株，92.2％(47/51)呈五重及以上耐藥，82.4％(42/51)呈六重及以上耐藥。8株雞源沙門菌的多重耐藥譜均不低于四重，且

3、其中兩株菌呈現(xiàn)出同時(shí)耐12重藥物。其他五株分離菌的耐藥譜均低于3重（其中Dpro為五重耐藥除外），且均對(duì)三代頭孢敏感。
　　 （二）ESBL檢測(cè)結(jié)果表明54.7％(35/64)受試菌為產(chǎn)ESBL菌。利用PCR法檢測(cè)64株受試菌攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)38株攜帶TEM基因，包括TEM-1亞型37株，TEM-57亞型1株，其中TEM-57亞型為首次在雞源分離菌中檢出。19株攜帶CTX-M基因，包括14株CTX-M-65，1

4、株CTX-M-14，3株CTX-M-24和1株CTX-M-90，其中CTX-M-90為首次發(fā)現(xiàn)并命名的一個(gè)新基因亞型，CTX-M-65亞型為首次在動(dòng)物源分離菌中檢出。由此得出CTX-M基因突變過(guò)程為CTX-M-14→CTX-M-24或CTX-M-90→CTX-M-65。21株攜帶OXA基因，包括11株OXA-1，2株OXA-2和16株OXA-10。說(shuō)明TEM-1是目前河南省養(yǎng)雞場(chǎng)雞源分離菌中的主要基因亞型，其次為OXA-10、CTX-M

5、-65和OXA-1。
　　 （三）分析產(chǎn)ESBL菌和非產(chǎn)ESBL菌攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因情況和多重耐藥譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)74.3％產(chǎn)ESBL菌(26/35)同時(shí)攜帶兩種以上β-內(nèi)酰胺酶基因，而僅6.9％(2/29)非產(chǎn)ESBL菌同時(shí)檢出2種β-內(nèi)酰胺酶基因。在35株產(chǎn)ESBL菌中，100％耐氨芐西林，對(duì)三代頭孢的耐藥率為77.1％～91.4％，對(duì)三代頭孢/酶抑制劑聯(lián)用的耐藥率為0～37.1％，同時(shí)，產(chǎn)ESBL菌的多重耐藥譜均不低于六重，

6、其中94.3％(33/35)為七重及以上耐藥菌株。而非產(chǎn)ESBL菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類的耐藥率均低于45％（氨芐西林除外），44.8％(13/29)的多重耐藥譜不低于6重，僅20.7％(6/29)不低于七重。比較產(chǎn)酶菌ESBL基因型與多重耐藥譜關(guān)系后發(fā)現(xiàn)47.4％(9/19)產(chǎn)CTX-M-ESBL菌多重耐藥譜不低于十重，而在16株非產(chǎn)CTX-M-ESBL菌中，僅18.8％(3/16)不低于十重。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在15株產(chǎn)CTX-M-65或CTX-M

7、-90菌株中，60％(9/15)多重耐藥譜超過(guò)10重，20％(3/15)為12重；而4株攜帶CTX-M-14或CTX-M-24菌株多重耐藥譜均低于10重。即攜帶CTX-M-65或CTX-M-90的菌株對(duì)受試藥物耐藥性較攜帶CTX-M-14或CTX-M-24菌株嚴(yán)重，提示CTX-M基因亞型的突變趨勢(shì)與細(xì)菌耐藥表型擴(kuò)大延伸方向基本一致。
　　 （四）采用1/2MIC頭孢曲松或頭孢噻肟誘導(dǎo)培養(yǎng)5株非產(chǎn)ESBL雞源大腸桿菌和O78。結(jié)果

8、發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)至10代時(shí)，頭孢曲松或頭孢噻肟的MIC值升高了8～64倍；培養(yǎng)至20代時(shí)，兩藥的MIC值又升高了2～16倍，其中頭孢噻肟誘導(dǎo)的O78已對(duì)頭孢噻肟耐藥；培養(yǎng)至30代時(shí)，誘導(dǎo)菌對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、慶大霉素、阿米卡星、多西環(huán)素、氟苯尼考和恩諾沙星均耐藥。說(shuō)明在單一抗菌藥定向選擇性壓力下，細(xì)菌表達(dá)多重耐藥表型的速度是較快的。
　　 （五）經(jīng)PCR檢測(cè)及測(cè)序分析，未誘導(dǎo)前O78為TEM-1型，頭孢噻肟誘導(dǎo)至20代時(shí)，TEM序列發(fā)

9、生一處堿基變異(24T→C)；誘導(dǎo)至30代時(shí)，TEM-1序列發(fā)生兩處堿基變異(24T→C，40C→T)，其中后一處堿基突變引起14Pro→Ser，即TEM-1基因可直接突變?yōu)橐粋€(gè)新基因亞型，說(shuō)明藥物定向誘導(dǎo)對(duì)菌株TEM基因變異起了重要作用。未誘導(dǎo)前，受試菌均不攜帶CTX-M基因，誘導(dǎo)至20代時(shí)，頭孢噻肟誘導(dǎo)O78已突變?yōu)镃TX-M-14-ESBL菌株；誘導(dǎo)至30代時(shí)，所有誘導(dǎo)菌株均成為CTX-M-ESBL（CTX-M-90和CTX-M-

10、65）菌株，說(shuō)明在三代頭孢定向選擇性壓力下，CTX-M型基因具有較快變異速度。分析各CTX-M基因序列推斷出CTX-M基因突變過(guò)程：非產(chǎn)ESBL菌首先獲得CTX-M-14基因，接著該基因發(fā)生氨基酸點(diǎn)突變成為CTX-M-90，然后CTX-M-90基因進(jìn)一步積累氨基酸點(diǎn)突變，菌株獲得CTX-M-65基因，隨著誘導(dǎo)的深入，CTX-M-65基因也開始出現(xiàn)堿基突變，但由于該突變僅為沉默突變，故暫時(shí)未有新基因亞型產(chǎn)生。此外，本誘導(dǎo)試驗(yàn)獲得的CTX-

11、M基因亞型均在前期雞源分離菌檢測(cè)時(shí)有檢出，說(shuō)明本誘導(dǎo)試驗(yàn)的推斷出的CTX-M基因突變過(guò)程可在一定程度上反映出臨床菌實(shí)際的突變過(guò)程，誘導(dǎo)藥物與臨床菌實(shí)際接觸的藥物相似。
　　 （六）利用PCR技術(shù)檢測(cè)51株雞源大腸桿菌中整合子流行情況。結(jié)果表明86.3％(44/51)檢出Ⅰ類整合子，3.9％(2/51)檢出Ⅱ類整合子，未檢出Ⅲ類整合子和非典型Ⅰ類整合子。基因盒插入?yún)^(qū)片段經(jīng)克隆、測(cè)序和比對(duì)后發(fā)現(xiàn)在44株Ⅰ類整合子中耐藥基因盒組合類型

12、包括sat(100％)、dfrA1/aadA1(45.4％)、dfrA17/aadA5(22.5％)、dfrA1/sat/aadA2(6，8％)和約4800bp的未知基因盒(27.3％)，其中dfrA1/sat/aadA2基因組合為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。進(jìn)一步采用巢式PCR和PCR定位技術(shù)檢出4800bp未知基因盒內(nèi)含有blacTX－M基因，且該基因位于基因盒區(qū)的中下游。兩株Ⅱ類整合子陽(yáng)性菌中檢出的耐藥基因盒組合均為dfrA1/sat1/aa

13、dA1。
　　 （七）分析雞源大腸桿菌整合子與ESBL的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)93.6％產(chǎn)ESBL雞源大腸桿菌(29/31)攜帶整合子，而在20株非產(chǎn)ESBL雞源大腸桿菌中，此數(shù)值為75％，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明整合子在產(chǎn)ESBL雞源大腸桿菌中分布更為集中。在15株攜帶整合子的非產(chǎn)ESBL菌中，80％菌株(12/15)攜帶一種整合子，且整合子的可變區(qū)僅整合了一種耐藥基因；而對(duì)29株攜帶整合子的產(chǎn)ESBL菌來(lái)說(shuō)，有89.6％菌株(