CTX--M--65型超廣譜β--內(nèi)酰胺酶的分布、傳播機制和基因環(huán)境研究.pdf

1、目的：
　　1989年在德國首次發(fā)現(xiàn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended spectrum beta-lactamases ESBL)。近年來，在第三、四代頭孢菌素以及新型廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的廣泛應(yīng)用所造成的抗性選擇壓力下，CTX-M型ESBL在臨床的檢出率日趨增高，已替代SHV型和TEM型，成為醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染中最常見的ESBL型別。CTX-M型ESBL在全球范圍呈現(xiàn)快速傳播趨勢，目前在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等至少2

2、6種細菌的菌株中均檢出有CTX-M型ESBL。CTX-M-65基因?qū)儆贑TX-M-9組，和CTX-M-14相較，有兩個位點的突變，即丙氨酸(GCC)80→纈氨酸(GTC)和絲氨酸(AGC)275→精氨酸(CGC)。自2007年于中國某醫(yī)院一弗氏檸檬酸桿菌分離株中首次發(fā)現(xiàn)CTX-M-65型ESBL后，十年間，blaCTX-M-65已在中國、韓國、美國等多個國家快速流行傳播，宿主菌涉及大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和沙門氏菌等多種菌屬，感染宿主涵

3、蓋人、家禽、野生動植物、水源等，存在于人類和動物日常生活的各個領(lǐng)域，嚴重威脅公共衛(wèi)生安全，妨礙畜牧業(yè)的發(fā)展。因此，對CTX-M-65基因分布、傳播機制及基因環(huán)境的研究，可以明確其基因定位，從而有效控制其轉(zhuǎn)移，遏制其擴散和傳播，臨床意義與社會價值顯著。
　　BlaCTX-M基因超過大半定位于質(zhì)粒上，少部分存在于染色體上。耐藥基因的定位和菌株的型別具有一定聯(lián)系。BlaCTX-M基因定位于質(zhì)粒上遺傳穩(wěn)定性較差，反之，存在于染色體上時，具

4、有良好的遺傳穩(wěn)定性。BlaCTX-M基因通過質(zhì)粒進行水平傳播，接合性質(zhì)?？梢越閷?dǎo)其在同種或不同種屬細菌之間轉(zhuǎn)移、傳播，促使耐藥菌株劇增，嚴重時導(dǎo)致泛耐藥菌株的爆發(fā)和流行。BlaCTX-M基因周圍的可移動遺傳序列，如blaCTX-M上游的插入序列ISEcpI、IS26和下游的插入序列IS903、ORF477等，對其表達和轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生非常關(guān)鍵的調(diào)控作用，上述可移動元件單獨或同時參與耐藥基因的表達與調(diào)控。
　　本課題組的前期研究中，在河南

5、地區(qū)首次從肺炎克雷伯菌中檢出blaCTX-M-65，但是本地其它菌種菌株中是否有blaCTX-M-65的流行，blaCTX-M-65上下游基因結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)移播散能力，以及流行菌株間是否具有關(guān)聯(lián)均不清楚。
　　為解決上述問題，我們進行該課題研究，擬通過統(tǒng)計分析所收集的臨床標本，明確河南地區(qū)攜blaCTX-M-65菌株的分布、流行情況;通過blaCTX-M-65的基因定位以及高通量測序，探明其基因環(huán)境;通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合實驗，分析blaCT

6、X-M-65的播散機制;通過多位點序列分型技術(shù)，研究攜blaCTX-M-65菌株的遺傳異質(zhì)性，目的是為臨床控制攜blaCTX-M-65菌株所致感染提供科學(xué)的指導(dǎo)。
　　方法：
　　1.菌株鑒定及藥敏分析收集2016年9月-2017年1月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科細菌室分離的，來源于痰液（含肺泡灌洗液）、分泌物（含膿液）、血液、尿液、糞便以及各種引流液等標本，對第三代頭孢菌素耐藥的革蘭陰性桿菌。所有實驗菌株均用VITEKⅡCO

7、MPACT微生物全自動鑒定分析儀鑒定到種。藥敏結(jié)果依據(jù)2016年CLSI標準判讀。
　　2.ESBL初篩和確證試驗嚴格按照CLSI2014年標準，進行可疑菌株ESBL初篩和確證實驗。
　　3.BlaCTX-M-65在細菌中的定位研究和基因環(huán)境分析PCR擴增blaCTX-M-9組基因，并將擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，置于UVP凝膠成像分析儀下分析，初步篩選出blaCTX-M-65基因陽性菌株。提取初篩陽性菌株的質(zhì)?；?，通過P

8、CR擴增后，測序，明確blaCTX-M-65基因在細菌中的定位，探明blaCTX-M-65的基因環(huán)境。
　　4.菌株的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合試驗通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合試驗，分析攜blaCTX-M-65基因質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性。
　　5.菌株的同源性分析通過多位點序列分型(MLST)技術(shù)，對攜blaCTX-M-65基因的菌株進行遺傳異質(zhì)性分析。
　　結(jié)果：
　　1.CTX-M-65型ESBL在革蘭陰性桿菌的分布測序結(jié)果顯示，在收集的36

9、9株耐三代頭孢菌素的革蘭陰性桿菌中，279株腸桿菌科細菌中12株攜blaCTX-M-65基因，其中10株肺炎克雷伯菌、2株大腸埃希菌。在90株非發(fā)酵菌中未檢出blaCTX-M-65基因。
　　2.ESBL初篩和表型確證試驗12株攜blaCTX-M-65菌株的ESBL確證試驗均表現(xiàn)為陰性。
　　3.BlaCTX-M-65的基因定位和基因環(huán)境分析所有菌株的blaCTX-M-65基因定位于質(zhì)粒上。BlaCTX-M-65基因上下游基

10、因元件擴增測序結(jié)果顯示，其上游主要為插入序列ISEcp1和IS26，下游均為插入序列IS903。共檢出四種不同種類的基因組件。組件一:IS26-ΔISEcp1-472bp-blaCTX-M-65-ΔIS903;組件二，IS26-ΔISEcp1-42bp-blaCTX-M-65-ΔIS903;組件三，IS26-ΔISEcp1-66bp-blaCTX-M-65-ΔIS903;組件四，blaCTX-M-65-ΔIS903。
　　4.質(zhì)粒

11、轉(zhuǎn)移接合試驗8個雙抗麥康凱平板上接合子均生長，供體菌、受體菌均不生長。通過提取接合子質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR擴增后測序結(jié)果進行局部序列比對法BLAST，blaCTX-M-65基因標準序列相似度100％。
　　5.MLST分型結(jié)果共獲得4種不同的ST型別。10株肺炎克雷伯菌的MLST分型結(jié)果為ST11和ST258，主要為ST11(8/10)。2株大腸埃希菌MLST分型結(jié)果為ST117和ST4360，分別來自呼吸科和新生兒科。
　　

12、結(jié)論：
　　1.河南地區(qū)CTX-M-65型ESBL在革蘭陰性桿菌中具有很高的流行率，且攜blaCTX-M-65菌株均為多重耐藥菌株。
　　2.所有分離菌株攜帶blaCTX-M-65基因定位于質(zhì)粒上。BlaCTX-M-65基因上游主要為插入序列ISEcp1和IS26，下游均為插入序列IS903。
　　3.可接合性質(zhì)粒及blaCTX-M-65周圍的插入序列ISEcp1、IS903等遺傳元件參與blaCTX-M-65基因的廣