CTX-M-55型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶在革蘭陰性桿菌中的基因定位、基因環(huán)境與傳播機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:
　　由于新型廣譜β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物和第三代頭孢菌素在臨床上的廣泛使用，造成CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended spectrum beta-lactamases ESBLs）檢出率呈逐年上升趨勢(shì)，且在全球范圍內(nèi)傳播快速，分布廣泛。自1986年首次檢出CTX-M酶以來(lái)，在社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染中，CTX-M已成為最為流行的ESBL型別之一，現(xiàn)已在大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、變形桿菌等至少26種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了C

2、TX-M酶。CTX-M-55酶屬于CTX-M-1組，自2004年首次在泰國(guó)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)CTX-M-55型ESBLs的大腸埃希菌至今，已在韓國(guó)、中國(guó)、印度、日本、美國(guó)、英國(guó)、俄羅斯等數(shù)十個(gè)國(guó)家快速流行傳播，宿主菌包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、黏質(zhì)沙雷桿菌、沙門(mén)菌屬、志賀菌屬等十余種病原菌。除人類(lèi)外，感染宿主還涉及家禽、牲畜、水源、蔬菜、野生動(dòng)植物等，覆蓋人類(lèi)生存生活的各個(gè)領(lǐng)域，對(duì)公共衛(wèi)生產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。因此，對(duì) CTX-M-55型 ESBLs的

3、傳播機(jī)制的研究有助于遏制其傳播，控制其轉(zhuǎn)移，臨床意義與社會(huì)價(jià)值重大。
　　blaCTX-M耐藥基因多數(shù)存在于質(zhì)粒，部分可定位于染色體上。耐藥基因是否定位于染色體，與菌株的型別有關(guān)系。定位于染色上的blaCTX-M耐藥基因具有遺傳穩(wěn)定性。質(zhì)粒是導(dǎo)致blaCTX-M耐藥基因水平傳播轉(zhuǎn)移的重要因素之一。接合型質(zhì)粒能通過(guò)接合傳遞在同種或不同種屬的細(xì)菌之間進(jìn)行穿梭，導(dǎo)致更多種類(lèi)細(xì)菌的耐藥，甚至在局部造成耐藥細(xì)菌的大規(guī)模爆發(fā)和流行。blaCT

4、X-M耐藥基因的基因環(huán)境，及其周?chē)蛟?duì)耐藥基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)移和傳播都有著極為重要的調(diào)控作用。如：位于blaCTX-M基因的上游的插入序列ISEcpI可使多種blaCTX-M耐藥基因高水平表達(dá)并能夠攜帶耐藥基因在染色體與質(zhì)粒之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，在不同菌種之間進(jìn)行傳播擴(kuò)散。插入序列IS26、IS903和ORF477也經(jīng)常與blaCTX-M耐藥基因相關(guān)。這些可移動(dòng)元件可隨機(jī)分布在blaCTX-M耐藥基因上下游，并在不同的 blaCTX-M耐藥基

5、因中組成不同形式的基因組件，共同或單獨(dú)作用于耐藥基因，對(duì)其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，其傳播進(jìn)行介導(dǎo)。CTX-M型ESBLs快速傳播的機(jī)制十分復(fù)雜。
　　我們前期在臨床1株肺炎克雷伯桿菌中首次檢出blaCTX-M-55型ESBLs，進(jìn)一步研究顯示 CTX-M-55是 CTX-M耐藥性進(jìn)程中重要一環(huán)，但是對(duì)于本地區(qū)CTX-M-55是否具有特殊的轉(zhuǎn)移播散能力？是否具有獨(dú)特的上下游基因結(jié)構(gòu)？國(guó)內(nèi)外流行菌株間是否有相關(guān)性尚不清楚。本研究擬通過(guò)基因定位、

6、高通量測(cè)序準(zhǔn)確分析明確基因環(huán)境；通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合實(shí)驗(yàn)探究其傳播機(jī)制從而為臨床延緩或控制細(xì)菌耐藥性的升級(jí)提供有價(jià)值的線(xiàn)索。
　　方法:
　　1．菌株收集收集2015年07月至2015年12月半年內(nèi)，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)菌室分離的耐三代、四代頭孢類(lèi)抗菌藥物的革蘭陰性桿菌共357株，所有菌株均采用VitekⅡCompact鑒定至種。
　　2．藥物敏感試驗(yàn)和ESBLs表型確證實(shí)驗(yàn)利用MIC法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，參照2014年CLS

7、I標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏結(jié)果判讀。根據(jù)2014年CLSI推薦的ESBLs篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行初步篩選并進(jìn)一步采用酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)進(jìn)行確證。
　　3．blaCTX-M-55耐藥基因篩選及定位分析采用PCR技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，挑取陽(yáng)性片段進(jìn)行測(cè)序分析，初步篩選blaCTX-M-55耐藥基因陽(yáng)性菌株。分別提取 blaCTX-M-55耐藥基因初篩陽(yáng)性菌株的染色體和質(zhì)粒DNA，采用PCR擴(kuò)增blaCTX-M-55，再進(jìn)行瓊脂糖

8、凝膠電泳和測(cè)序，確定blaCTX-M-55耐藥基因在細(xì)菌中的位置。
　　4．傳播轉(zhuǎn)移機(jī)制分析對(duì)定位于質(zhì)粒上的陽(yáng)性菌株進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)。通過(guò)以上試驗(yàn)分析blaCTX-M-55耐藥基因的傳播轉(zhuǎn)移機(jī)制。
　　5．耐藥菌株的同源性分析采用多位點(diǎn)序列分型（MLST）對(duì) blaCTX-M-55耐藥基因陽(yáng)性的菌株進(jìn)行同源性分析
　　結(jié)果:
　　1. blaCTX-M-55耐藥基因的檢出結(jié)果
　　357株ESBLs陽(yáng)性

9、菌株中共13株病原菌攜帶blaCTX-M-55，且均為腸桿菌科細(xì)菌，其中包括大腸埃希菌7株，肺炎克雷伯桿菌3株，弗氏檸檬酸桿菌1株，黏質(zhì)沙雷桿菌1株和摩根摩根菌1株。非發(fā)酵菌中未有blaCTX-M-55耐藥基因陽(yáng)性菌株檢出。
　　2．基因定位與質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　基因定位分析結(jié)果顯示所有菌株的blaCTX-M-55耐藥基因均被質(zhì)粒所攜帶且質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合實(shí)驗(yàn)接合率為100％。
　　3．基因環(huán)境檢測(cè)結(jié)果
　　經(jīng)檢

10、測(cè)，blaCTX-M-55耐藥基因與其上下游基因元件共形成四種不同模式的基因組件。在13株blaCTX-M-55耐藥基因上游均發(fā)現(xiàn)ISEcp1的存在，其中兩株被IS26插入截?cái)啵恢瓯籌S1294插入；在12株blaCTX-M-55耐藥基因下游發(fā)現(xiàn)ORF477，另外1株下游為IS903。ISEcp1?-blaCTX-M-55-?IS903基因組件是一種新型組合形式，在blaCTX-M-55首次檢出。10株含有Int1類(lèi)整合子，1株為In

11、t2類(lèi)整合子，2株未檢出整合子類(lèi)型。13株 blaCTX-M-55耐藥基因陽(yáng)性菌株中有5株同時(shí)攜帶blaTEM，兩株同時(shí)攜帶blaTEM和blaSHV。
　　4．MLST分型情況
　　對(duì) blaCTX-M-55耐藥基因陽(yáng)性的7株大腸埃希菌和3株肺炎克雷伯桿菌進(jìn)行MLST分型，共檢測(cè)出9種ST型別，其中兩株來(lái)自不同科室（消化內(nèi)科和ICU）的大腸埃希菌的ST型別一致（ST305），其與菌株的ST均不相同[ST305, ST182

12、, ST381, ST446 and ST2(大腸埃希菌) and ST148, ST269 and ST37(肺炎克雷伯桿菌)]。
　　結(jié)論:
　　1．CTX-M-55型ESBLs在本地區(qū)已然形成多菌種擴(kuò)散蔓延趨勢(shì)，尤以腸桿菌科細(xì)菌為甚，需引起臨床的高度警惕，嚴(yán)防出現(xiàn)院內(nèi)感染的爆發(fā)流行。
　　2.可接合型質(zhì)粒、ISEcp1等blaCTX-M-55基因周?chē)梢苿?dòng)元件是其在細(xì)菌間傳播轉(zhuǎn)移的主要因素。臨床應(yīng)增強(qiáng)blaCTX