CTX-M-3型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的原核表達和純化.pdf

1、目的：對肺炎克雷伯菌所產(chǎn)CTX-M-3型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBLs）進行基因重組表達及純化。
　　 方法：對保存重組細菌DH5α/pGEM-T-CTX-M-3菌種鑒定和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶確證后，對其所產(chǎn)的CTX-M-3型酶基因進行序列分析，明確酶基因表型。構(gòu)建原核表達載體pET-28a(+)與CTX-M-3編碼基因的重組體，并在大腸桿菌BL21（DE3）中原核表達。

2、IPTG誘導CTX-M-3融合蛋白表達，表達產(chǎn)物經(jīng)過親和層析純化，用SDS-PAGE電泳和免疫印跡法(Western-blot)鑒定該純化蛋白。
　　 結(jié)果：（1）pGEM-T-CTX-M-3重組菌質(zhì)粒經(jīng)NdeI和EcoRI酶切后獲得的片段大小約為876 bp和3000 bp。核苷酸序列分析結(jié)果顯示，目的基因片段大小為876 bp，經(jīng)GenBank同源性比較，與GenBank上登錄的CTX-M-3 100％符合。
　　

3、（2）成功構(gòu)建pET-28a(+)-CTX-M-3重組質(zhì)粒，經(jīng)NdeI和EcoRI雙酶切后，獲得大小約為876 bp和5000 bp的片段，與預期大小相符，證明目的基因已經(jīng)成功插入pET-28a(+) 載體中。
　　 （3）可溶性檢測表明表達產(chǎn)物以可溶性形式(上清中)和包涵體形式(沉淀中)兩種形式存在。通過蛋白表達條件的優(yōu)化實驗，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示18℃、0.8mmol/L IPTG誘導24h的CTX-M-3重組蛋白的