CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶多克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、廣譜抗菌藥物,尤其是第三、四代頭孢菌素的應(yīng)用,為臨床抗感染治療作出貢獻的同時,也逐步使其面臨著嚴(yán)峻的考驗?？咕幬锏牟缓侠硎褂?對病原菌可形成選擇壓力并篩選出多重耐藥菌株；多種基因轉(zhuǎn)移元件的存在及其菌間頻繁傳遞,可致多重耐藥性的傳播與流行。臨床抗感染治療時常面對無藥可用的境地。探究菌株多重耐藥機制,涉及產(chǎn)生水解酶與鈍化酶、主動外排、藥物作用靶位改變以及胞膜滲透性改變等,而最為關(guān)鍵的是產(chǎn)生了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶。
　　 自1983年

2、首例產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株發(fā)現(xiàn)以來,產(chǎn)酶菌株呈世界范圍內(nèi)流行。菌株種類涵蓋腸桿菌科、非發(fā)酵菌科細(xì)菌等；單菌株攜帶酶型存在地域性分布特征；各型別酶抗藥活性問存在一定差異。明確各地區(qū)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶流行型別抗藥活性,早期完成產(chǎn)酶菌株分離、鑒定,對于正確指導(dǎo)臨床抗感染治療,最終降低產(chǎn)酶菌株的產(chǎn)生幾率及阻斷產(chǎn)酶菌株流行意義重大。
　　 抗菌藥物應(yīng)用習(xí)慣差異,造成各地域間超廣譜β-內(nèi)酰胺酶流行型別不同。在我國大部分地區(qū)臨床分離菌株所產(chǎn)

3、酶型中,CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶占有相當(dāng)比例。該型酶由德國學(xué)者Bauernfeind首先發(fā)現(xiàn)(CTX-M-1),目前已有數(shù)十種亞型,其分布地域及宿主菌譜極為廣泛。CTX-M型酶水解底物為青霉素類、第一、二代頭孢菌素,部分型別可水解頭孢吡肟?；诿傅鞍捉Y(jié)構(gòu)構(gòu)象特征以及藥物自身空間位阻差異,CTX-M型酶對頭孢噻肟的水解能力顯著高于頭孢他啶,部分菌株體外試驗對頭孢他啶顯示高度敏感。根據(jù)氨基酸序列同源性分析結(jié)果,可將CTX-M型超廣譜β

4、-內(nèi)酰胺酶分為5組,各組間氨基酸序列同源性小于90％,組內(nèi)性大于94％。各組間DNA突變位點可位于編碼基因的任一部位。進一步研究表明,盡管CTX-M型酶各亞型間核苷酸序列差異較大,但從酶蛋白結(jié)構(gòu)上看,各突變位點多遠(yuǎn)離酶活性中心,對于酶蛋白抗藥活性影響不大。故各亞型酶均具有CTX-M型酶的共有特性。基于此,明確一種型別CTX-M型酶的耐藥譜,對于其他型別抗藥活性的抑制具有指導(dǎo)價值。
　　 目前,臨床實驗室對于產(chǎn)酶菌株的鑒定主要采用

5、三種方式,采用雙紙片協(xié)同試驗初步篩選陽性菌株；采用酶抑制劑增強試驗/E-test試驗進行確證；采用分子生物學(xué)試驗進行快速特異性鑒定。前兩者均需完成菌株的分離培養(yǎng),耗時較長,難以滿足臨床簡單快速的要求。后者試驗費用較高,且實驗軟、硬件要求高,一般實驗室難以開展。
　　 為了解決上述問題,作者采用雙紙片協(xié)同及酶抑制劑增強試驗篩選、收集46株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌；采用PCR技術(shù)克隆CTX-M型酶表達(dá)基因；采用基因重組技術(shù)構(gòu)建

6、CTX-M表達(dá)載體并表達(dá)；采用液體稀釋法完成抗藥活性檢測。同時,通過免疫小鼠獲得超廣譜β-內(nèi)酰胺酶特異性抗體；設(shè)計完善酶聯(lián)免疫吸附試驗,建立CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的快速鑒定方法。通過上述試驗,在明確CTX-M型酶抗藥活性的同時,可獲得其多克隆抗體,用于快速鑒定,乃至于被動免疫治療。
　　 本研究包括以下三個部分。
　　 第一部分 CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)、定位及其抗藥活性研究
　　 方法

7、：
　　 1.采用雙紙片協(xié)同試驗及酶抑制劑增強試驗,對46株臨床分離多重耐藥大腸埃希菌進行超廣譜β-內(nèi)酰胺酶篩選與確證。
　　 2.依據(jù)CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶核苷酸序列特征,采用DNAstar分析軟件,完成特異性PCR擴增引物設(shè)計。
　　 3.采用PCR技術(shù),完成CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶全長編碼基因的克隆。
　　 4.采用基因重組技術(shù),完成pET-28a-CTX-M-38表達(dá)質(zhì)粒

8、的構(gòu)建。
　　 5.采用氯化鈣轉(zhuǎn)化法,完成pET-28a-CTX-M-38表達(dá)質(zhì)粒在BL21大腸埃希菌中的轉(zhuǎn)化。
　　 6.采用卡那霉素抗性試驗,檢測BL21-pET-28a-CTX-M-38轉(zhuǎn)化子構(gòu)建效果。
　　 7.采用雙脫氧鏈終止法對質(zhì)粒插入片段進行核苷酸序列分析,檢測所克隆CTX-M-38型編碼基因序列突變狀況。
　　 8.采用液體稀釋法,檢測BL21-pET-28a-CTX-M-38轉(zhuǎn)化子抗藥活

9、性。
　　 9.采用K-B法藥物敏感試驗,檢測培養(yǎng)液上清及菌體裂解液中CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶活性,初步進行酶蛋白定位研究。
　　 結(jié)果：
　　 1.阿莫西林表現(xiàn)耐藥,阿莫西林/克拉維酸表現(xiàn)敏感,兩者交界處有協(xié)同現(xiàn)象,抑菌環(huán)直徑明顯擴大,產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株篩選試驗陽性。
　　 2.頭孢他啶抑菌環(huán)直徑為8mm,頭孢他啶/克拉維酸抑菌環(huán)直徑為26mm,兩者之差顯著大于5mm,表明酶抑制劑增強

10、試驗陽性,產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株確證試驗陽性。
　　 3.瓊脂糖凝膠電泳顯示,PCR擴增陽性產(chǎn)物大小與設(shè)計結(jié)果相一致。
　　 4.以轉(zhuǎn)化子攜帶質(zhì)粒為模板進行PCR擴增,約900bp位置處有目的條帶,提示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 5.轉(zhuǎn)化子在含卡那霉素液體培養(yǎng)基中生長良好,表明轉(zhuǎn)化子構(gòu)建成功。
　　 6.目的基因核苷酸序列與Bla CTX-M-38基因序列比對結(jié)果顯示,兩者在663位點處存在突變(T→A)

11、,但氨基酸序列上,兩者221位均為丙氨酸,提示此處突變?yōu)橥x突變。
　　 7.K-B法藥敏試驗中,滴加上清及菌體裂解液的頭孢噻肟紙片均顯示耐藥,但后者抗藥活性較為顯著,單純頭孢噻肟紙片顯示敏感,提示表達(dá)產(chǎn)物主要分布于菌體中。
　　 8.轉(zhuǎn)化子對青霉素類藥物包括哌拉西林、氨芐西林顯著耐藥(MIC>32μg/ml),對于頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢呋辛及頭孢克洛MIC值>16μg/ml,表現(xiàn)為耐藥。頭孢噻肟及頭孢曲松酶水解活性較

12、強(MIC值均>32μg/ml)。頭孢他啶MIC值為8μg/ml,表現(xiàn)為體外敏感。轉(zhuǎn)化子對亞胺培南穩(wěn)定敏感,MIC≤4μg/ml。酶抑制劑復(fù)合制劑中,哌拉西林仨唑巴坦敏感(MIC≤16/4μg/ml),而阿莫西林/棒酸、氨芐西林/舒巴坦均表現(xiàn)耐藥(MIC>32/16μg/ml)。頭孢哌酮/舒巴坦MIC為32/16μg/ml,表現(xiàn)為中介。氨曲南表現(xiàn)為敏感(MIC≤8μg/ml)。非內(nèi)酰胺類抗菌藥物中,慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星

13、及美滿霉素均表現(xiàn)為耐藥。
　　 第二部分 CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶多克隆抗體的制備
　　 方法：
　　 1.采用IPTG誘導(dǎo)BL21-pET-28a-CTX-M-38轉(zhuǎn)化子表達(dá)酶蛋白。
　　 2.采用水煮裂解法,完成全菌蛋白提取。
　　 3.采用超聲破碎法,完成包涵體蛋白提取。
　　 4.采用SDS-PAGE蛋白電泳技術(shù),檢測BL21-pET-28a-CTX-M-38轉(zhuǎn)化子表達(dá)

14、產(chǎn)物。
　　 5.采用擴散洗脫法,回收與純化CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶蛋白。
　　 6.采用傳統(tǒng)多克隆抗體制備方法,制備CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶蛋白特異性抗體。
　　 7.采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗,檢測所制備多克隆抗體效價。
　　 8.采用辛酸沉淀法,對所制備的多克隆抗體進行純化。
　　 9.采用Western blot印跡雜交技術(shù),進行多克隆抗體的特異性鑒定。
　　

15、 結(jié)果：
　　 1.SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果顯示,BL21-pET-28a-CTX-M-38轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液上清、全菌蛋白、包涵體蛋白泳道,在約30kDa處出現(xiàn)明顯蛋白條帶,目的酶蛋白分子量大小與設(shè)計相同,表明在IPTG誘導(dǎo)作用下,轉(zhuǎn)化子可顯著表達(dá)酶蛋白。
　　 2.SDS-PAGE蛋白電泳后,各泳道酶蛋白量多少依次為包涵體蛋白、全菌蛋白以及培養(yǎng)液上清,提示轉(zhuǎn)化子表達(dá)產(chǎn)物主要存在于包涵體內(nèi)。
　　 3.間接酶聯(lián)免

16、疫吸附試驗結(jié)果顯示,多克隆抗體1:1000至1:16000梯度稀釋度檢測結(jié)果均呈陽性。1:32000以后稀釋度時無陽性結(jié)果出現(xiàn),表明多克隆抗體效價為1:16000,也表明多克隆抗體制備成功。
　　 4.Western blot印跡雜交技術(shù)檢測結(jié)果顯示,不同稀釋度的抗體均與同一蛋白條帶(約30kDa)反應(yīng),此條帶與CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶蛋白大小相一致。提示研究中所制備多克隆抗體特異性較好。
　　 第三部分 C

17、TX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶多克隆抗體的應(yīng)用研究
　　 方法：
　　 1.采用梅花形雙向瓊脂擴散試驗,完成CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶蛋白與多克隆抗體反應(yīng)最適比檢測。其中選擇4h培養(yǎng)物作為試驗抗原濃度,系列抗體滴度采用倍比稀釋法制備。
　　 2.采用K-B法藥物敏感試驗,進行多克隆抗體抑制酶蛋白活性研究。
　　 3.采用改良過碘酸鈉法,進行酶標(biāo)多克隆抗體的制備。
　　 4.采用50％

18、飽和硫酸銨沉淀法,進行酶標(biāo)多克隆抗體的純化。
　　 5.依據(jù)雙抗體夾心法原理,設(shè)計制備酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒。
　　 6.針對BL21-pET-28a-CTX-M-38轉(zhuǎn)化子表達(dá)產(chǎn)物進行平行試驗,檢測批內(nèi)變異,評價實驗重復(fù)性。
　　 7.與PCR技術(shù)進行平行對照試驗,完成臨床分離產(chǎn)酶菌株檢測,評價方法特異性。
　　 8.對27株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌(不攜帶CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

19、)進行檢測,評價抗體交叉反應(yīng)狀況。
　　 9.對產(chǎn)CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株不同時間段培養(yǎng)液進行檢測,明確超廣譜β-內(nèi)酰胺酶最適檢測時間。
　　 結(jié)果：
　　 1.結(jié)果顯示,抗體效價為1:64時,沉淀線出現(xiàn)在兩反應(yīng)孔中間位置,表明抗體與4h培養(yǎng)物反應(yīng)的最適效價為1:64。
　　 2.K-B法藥敏試驗結(jié)果顯示,抗體組抗菌藥物抑菌環(huán)直徑與對照組比較,p值小于0.01,兩者結(jié)果有差異。表明CTX-

20、M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶蛋白與多克隆抗體結(jié)合后,其活性受到一定程度的抑制。
　　 3.多克隆抗體抑制效應(yīng)表現(xiàn)為阿莫西林、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南等藥物的抑菌環(huán)直徑增大,菌株由耐藥轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾谢騇IC進一步減小。含酶抑制劑復(fù)合藥物兩組結(jié)果基本相同。頭孢噻肟抑菌環(huán)兩組結(jié)果均無變化。
　　 4.對轉(zhuǎn)化子表達(dá)產(chǎn)物30次平行試驗結(jié)果顯示,CV值為1.55％,提示本法批內(nèi)變異小,具有較好的重復(fù)性。
　　 5.146株產(chǎn)超

21、廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌中,PCR技術(shù)檢測陽性率為4.11％,本法為7.53％,x2檢測可知P>0.05,表明兩種檢測方法檢測結(jié)果無差異,提示本法具有一定的特異性。
　　 6.交叉反應(yīng)試驗中,27株臨床分離產(chǎn)酶菌株中,有1株檢測結(jié)果為陽性。表明所制備抗體具有交叉反應(yīng),實驗結(jié)果存在假陽性現(xiàn)象。
　　 7.超廣譜β-內(nèi)酰胺酶最適檢測時間結(jié)果顯示,宿主菌在培養(yǎng)2h后,即有酶蛋白產(chǎn)生。4h時酶量顯著增多,8h、18h及24h酶

22、蛋白量已超過檢測線性范圍,故吸光度改變不大。結(jié)合檢驗流程,本研究確定超廣譜β-內(nèi)酰胺酶最適檢測時間為菌株培養(yǎng)4h。
　　 結(jié)論：
　　 1.CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶主要定位于宿主菌包涵體內(nèi);轉(zhuǎn)化子具有廣泛抗藥活性,對部分抗菌藥物抗藥活性與其他型別存在差異。
　　 2.完成了CTX-M-38型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶多克隆抗體的制備、純化與鑒定,所制備多克隆抗體效價為1:16000;抗體與CTX-M-38型超