多重耐藥革蘭氏陰性桿菌β-內(nèi)酰胺酶的基因型研究.pdf

1、青霉素和頭孢霉素等β-內(nèi)酰胺類抗生素的發(fā)現(xiàn)與使用為人類抵抗細(xì)菌感染作出了貢獻(xiàn)，挽救了無數(shù)人的生命。但是在長期使用中，細(xì)菌逐漸對其產(chǎn)生抗藥性，使其抗菌作用減弱或消失，經(jīng)常出現(xiàn)使用效果不理想的現(xiàn)象。β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是革蘭氏陰性菌對該類抗生素耐藥的主要機(jī)制之一，臨床上的β-內(nèi)酰胺酶主要是ESBLs、AmpC酶和MBL。研究認(rèn)為質(zhì)粒攜帶的β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因在質(zhì)粒間及質(zhì)粒與染色體間轉(zhuǎn)移主要是通過轉(zhuǎn)座子或整合子為工具實(shí)現(xiàn)的。整合子系統(tǒng)作為一種可

2、移動(dòng)的遺傳元件，可捕獲和整合細(xì)菌的耐藥基因，在細(xì)菌耐藥基因的水平傳播中起到重要的作用。 目的：以醫(yī)院感染中常見致病菌多重耐藥革蘭氏陰性菌為對象，檢測β-內(nèi)酰胺酶表型、β-內(nèi)酰胺酶基因和整合子，了解其耐藥特性、基因種類和分布特點(diǎn)；找到可誘導(dǎo)DHA-1與ACT-1型AmpC酶，為下一步的蛋白質(zhì)組學(xué)研究打下基礎(chǔ)，明確整合子機(jī)制在多重耐藥中的作用。為指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗生素，預(yù)防和控制耐藥菌及耐藥基因的傳播提供科學(xué)的依據(jù)。 方法：

3、紙片擴(kuò)散初篩法從臨床分離的302株多重耐藥革蘭氏陰性桿菌中篩選出80株可疑產(chǎn)酶株，然后用紙片擴(kuò)散確證法、頭孢西丁三維試驗(yàn)、MBL的協(xié)同試驗(yàn)進(jìn)行確證；采用法國梅里埃API生化鑒定試條：經(jīng)VITEK-2鑒定系統(tǒng)鑒定細(xì)菌到種；藥敏試驗(yàn)用K-B法，經(jīng)WHONET5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析其耐藥特性；用多重PCR技術(shù)檢測A、B、C、D4組β內(nèi)酰胺酶基因和整合子，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行T-A克隆和DNA測序，進(jìn)行基因分型；對新型CMY型AmpC

4、編碼基因進(jìn)行克隆和序列分析，了解其突變的情況；用套式PCR技術(shù)和接合試驗(yàn)探討CMY型AmpC轉(zhuǎn)移的途徑。 結(jié)果 一、β-內(nèi)酰胺酶表型試驗(yàn)的檢出率 302株革蘭氏陰性桿菌β-內(nèi)酰胺酶的表型試驗(yàn)篩選出80株可疑產(chǎn)酶株，總檢出率為26.49％(80/302)。其中主要由產(chǎn)ESBLs引起的，占17.55％(53/302)；其次為ESBLs+AmpC引起，占6.62％(20/302)；為ESBLs+AmpC+MBL引起，占

5、1.65％(5/302)，單獨(dú)由AmpC引起的僅占0.66％(2/302)。 二、多重耐藥革蘭陰性桿菌的耐藥譜 80株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶多重耐藥革蘭陰性桿菌對臨床常用抗生素耐藥率最低為丁氨卡那(18.99％)、其次為亞胺培南(20.0％)，頭孢哌酮/舒巴坦(21.7％)、哌拉西林/他唑巴坦(21.89％)；最高為氨芐西林(98.33％)，其次為氨芐西林/舒巴坦(83.33％)、頭孢曲松(76.25％)、頭孢西丁(63.64％

6、)及頭孢噻肟(60.50％)等，大部分細(xì)菌呈多重耐藥性。 三、PCR反應(yīng)及序列測定結(jié)果 1.β-內(nèi)酰胺酶基因的擴(kuò)增結(jié)果 TEM、SHV、CTX-M-G1、CTX-M-G2、CTX-M-G3、PSE、DHA-1、ACT-1、CMY、IMP1及Int總陽性率在本院臨床分離的80株β-內(nèi)酰胺酶多重耐藥革蘭陰性桿菌中分別為：19.20％(58/302)、8.94％(27/302)、10.60％(32/302)、0.33％

7、(1/302)、0.33％(1/302)、1.97％(6/302)、0.99％(3/302)、4.64％(14/302)、0.99％(3/302)、0.33％(1/302)及16.5％(50/302)。產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶多重耐藥革蘭氏陰性桿菌株的總陽性率24.83％(75/302)，單產(chǎn)ESBLs的多重耐藥革蘭氏陰性桿菌株占17.55％(53/302)，同時(shí)產(chǎn)ESBLs與AmpC的菌株占6.95％(21/302)，ESBLs、MBL與Amp

8、C的菌株占0.33％(1/302)，單產(chǎn)AmpC的菌株占0.33％(1/302)。找到一種廣州地區(qū)未報(bào)道過的基因：CTX-M-15和一種新型CMY型AmpC酶。大部分多重耐藥革蘭氏陰性桿菌都攜帶4-6種β-內(nèi)酰胺酶。 2.整合子序列PCR擴(kuò)增結(jié)果 整合子檢測結(jié)果：對80株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶多重耐藥革蘭氏陰性菌用兼并引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，有50株檢出整合子。有21.2％的菌株同時(shí)對十種抗生素都耐藥，依次為氨卞西林(72.5％)、

9、頭孢曲松(62.5％)、頭孢唑啉(61.2％)、頭孢他啶(56.2％)、哌拉西林(55.0％)、復(fù)方磺胺嘧啶(51.2％)、環(huán)丙沙星(50％)、慶大霉素(48.8％)、頭孢吡肟(48.8％)、頭孢西丁(33.8％)，顯著高于整合子陰性的菌株；用可變引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，有29株檢出Ⅰ類整合子，兼并引物的檢出率比可變引物的高，可變引物可擴(kuò)增出1000bp，1450bp，1600bp，1700bp，1850bp，1900bp，大于2000bp

10、等多種不同長度的DNA片段。同一菌屬攜帶有不同的耐藥基因片段，不同菌屬攜帶有相同的耐藥基因片段。 3.新型CMYAmpC酶編碼基因的克隆和序列分析 擴(kuò)增CMY全序列，經(jīng)T-A克隆后經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)：在中間序列發(fā)生了多處的突變，與CMY-2、CMY-Y4與CMY-22序列各有97％的同源性，氨基酸序列與CMY-13有98％的同源性，對頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁等多種抗生素耐藥，是兩種新型的CMY基因型，GenBank

11、登陸號為：DQ443436、DQ443437。整合子用套式PCR擴(kuò)增未發(fā)現(xiàn)CMY條帶，對整合子基因盒插人區(qū)的擴(kuò)增片段進(jìn)行分子克隆和DNA序列分析，整合子并未發(fā)現(xiàn)CMY基因。接合試驗(yàn)顯示CMY基因可通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。 結(jié)論 1.用PCR反應(yīng)檢測β-內(nèi)酰胺酶的基因簡便、準(zhǔn)確。此次檢出本院多重耐藥革蘭氏陰性桿菌β-內(nèi)酰胺酶的基因型有：TEM、SHV、CTX-M-G1、CTX-MM-G2、CTX-M-G3、PSE、DHA-1、ACT

12、-1、CMY、IMP1，以單產(chǎn)ESBLs的為主17.55％(53/302)，同時(shí)產(chǎn)ESBLs與AmpC的菌株占21/302(6.95％)，大部分多重耐藥革蘭氏陰性桿菌都攜帶4-6種β-內(nèi)酰胺酶。 2.整合子廣泛分布于我院的多重耐藥革蘭氏陰性桿菌中，質(zhì)粒定位和整合子介導(dǎo)的抗藥性基因盒可能是導(dǎo)致產(chǎn)酶株多重耐藥性產(chǎn)生和(或)播散的重要原因。 3.篩選出DHA-1與ACT-1可誘導(dǎo)型AmpC酶，為進(jìn)一步研究AmpC酶耐藥機(jī)制的蛋