β-內(nèi)酰胺酶新基因型LEN-5的研究.pdf

1、目的: 研究β-內(nèi)酰胺酶新耐藥基因LEN-5的耐藥性及其表達(dá)產(chǎn)物的各種理化性質(zhì)和酶特性。通過對新型β-內(nèi)酰胺酶基因的發(fā)現(xiàn)和研究，為此類耐藥細(xì)菌的檢測、治療及監(jiān)控提供依據(jù)，也為新β-內(nèi)酰胺酶抑制劑及新抗菌藥物的研制和開發(fā)提供必要條件，而且為人類對細(xì)菌耐藥基因的知識增添新的素材，也可為臨床治療這種細(xì)菌感染合理應(yīng)用抗生素、預(yù)防和控制耐藥菌株的出現(xiàn)和傳播以及細(xì)菌的流行病學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和指導(dǎo)。 方法: (1)通過接合試

2、驗(yàn)分析耐藥質(zhì)粒的傳播機(jī)制； (2)應(yīng)用PCR法擴(kuò)增接合子耐藥基因片斷，并測序，然后利用DNAMAN軟件與LEN-5基因進(jìn)行對比分析； (3)應(yīng)用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA； (4)把新發(fā)現(xiàn)的LEN-5基因連接到PET-26(+)載體，克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a和BL21； (5)應(yīng)用超聲破壁法提取β-內(nèi)酰胺酶； (6)應(yīng)用等電聚焦電泳測定其等電點(diǎn)； (7)用紙片擴(kuò)散法比較臨床分離株和接合子的耐

3、藥性； (8)應(yīng)用瓊脂二倍稀釋法檢測12種抗生素對臨床分離株、結(jié)合子和重組菌的最低抑菌濃度(MIC)。 結(jié)論: 本課題組首次在深圳市人民醫(yī)院發(fā)現(xiàn)一種新型β-內(nèi)酰胺酶基因，經(jīng)世界權(quán)威專家確認(rèn)，此基因被命名為LEN-5，GenBank注冊號為(AY633109)，已被收錄于美國Lahey臨床醫(yī)學(xué)中心的專業(yè)網(wǎng)站(http://www.lahey.org/Studies)。 含LEN-5基因產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯

4、菌自然轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，轉(zhuǎn)移后基因穩(wěn)定表達(dá)，耐藥性沒有改變，會引起廣泛流行；耐藥基因在抗生素選擇性壓力下，發(fā)生突變的速度很快，LEN-5與LEN-2基因具有98.6％的同源性，只有4個(gè)氨基酸的差異；藥物敏感試驗(yàn)顯示，臨床分離株和接合子的耐藥性高度吻合；目前亞胺培南是最有效的藥物；LEN-5基因重組研究，在誘導(dǎo)劑(IPTG)作用下酶可穩(wěn)定表達(dá)；新LEN-5耐藥基因細(xì)菌有可能成為引起醫(yī)院感染流行的危險(xiǎn)因素，應(yīng)合理選用抗生素進(jìn)行抗感染治療，嚴(yán)格控制