耐藥銅綠假單胞菌產金屬β內酰胺酶基因型研究及相關整合子分析.pdf

1、廣州市第一人民醫(yī)院2001-2002年曾爆發(fā)呼吸機相關性泛耐藥銅綠假單胞菌(Pan resistant PselJdomonas aeruginosa，PRPA)感染，出現了對亞胺培南、頭孢他啶、哌拉西林、環(huán)丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、左旋氧氟沙星、氨基糖甙類抗生素等除多黏菌素外臨床可獲得抗生素均耐藥的嚴重情況，使臨床醫(yī)生感到束手無策．前期體外實驗說明使用金屬β-內酰胺酶抑制劑乙二胺四乙酸(EDTA)可恢復PRPA對亞

2、胺培南的部分敏感性，提示會屬β-內酰胺酶的產生可能是PRPA耐藥的重要原因。金屬β-內酰胺酶是近10年新發(fā)現的一類對抗碳青霉烯類抗生素和第三代頭孢菌素在內的β內酰胺類抗生素(包括克拉維酸、舒巴坦和他嘩巴坦)高度耐藥的β內酰胺酶。本研究旨在調查金屬β-內酰胺酶及相關整合子在泛耐藥、MDRP上所起的作用，結合臨床資料進行對比分析，以期提供相應的分子流行病學資料。 第一部分：泛耐藥、多藥耐藥及普通感染銅綠假單胞菌的篩選及金屬β-內酰胺

3、酶基因型及表型的鑒定 目的：1．檢測泛耐藥、多藥耐藥及普通感染銅綠假單胞菌金屬β-內酰胺酶存在情況；2．確定此金屬β-內酰胺酶基因型。 方法：1．在廣州市第一人民醫(yī)院細菌室通過Whonet5.3軟件(世界衛(wèi)生組織推薦)查找2002年-2005年符合條件泛耐藥、多藥耐藥、普通感染銅綠假單胞菌。采用VITEK 2全自動微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)對其進行重新鑒定。K-B紙片法對其重新進行體外藥敏實驗，并將其歸類；2．采用聚合酶鏈反應

4、(polymerase chainreaction，PCR)擴增金屬β-內酰胺酶基因。登陸Genebank后分析其基因型；3．采用紙片協(xié)同法和金屬β-內酰胺酶E-Test試紙條法對上述三組銅綠假單胞菌進行金屬β-內酰胺酶表型檢測，與測序結果進行對比，進行方法學比較：4．采用Fisher 確切概率法，進行統(tǒng)計學分析，P<0.01有統(tǒng)計學意義。 結果：1．經VITEK 2全自動微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)鑒定確定為銅綠假單胞菌，體外藥敏結果

5、證實PRPA共7株，多藥耐藥銅綠假單胞菌(Multi-drugresistant Pseudomonas aeruginosa，MDRP)為10株，普通感染銅綠假單胞菌為10株，共27株臨床菌株；2．采用PCR法共檢出7株IMP金屬β-內酰胺酶基因陽性，大小約為500bp，序列分析與IMP-1型有99％同源性，設計合成IMP-1型上下游引物，繼續(xù)PCR反應，7株均陽性，大小約800bp左右，測序序列分析證實為IMP-1金屬β-內酰胺酶基

6、因型(100％同源性)；3．金屬β-內酰胺酶E-Test檢測方法總符合率(96.5％)高于紙片協(xié)同法(85.1％)，E-Test檢測方法特異率(100％)高于紙片協(xié)同法(85％)，兩者敏感率相同(85.7％)，E-Test檢測方法陽性預測值(100％)高于紙片協(xié)同法(66.6％)，其陰性預測值(95.2％)高于紙片協(xié)同法(94.4％)；4．經統(tǒng)計學分析，泛耐藥、多藥耐藥及普通感染銅綠假單胞菌中產金屬β-內酰胺酶有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.

7、0001)． 結論：1．本院PRPA均產IMP-1型金屬β-內酰胺酶，并由質粒介導；2．E-Test法檢測金屬β-內酰胺酶要優(yōu)于紙片協(xié)同法，是種快速可靠的檢測金屬酶的方法；3．產IMP-1型金屬β-內酰胺酶菌不是本院MDRP的主要耐藥機制，由MDRP轉變?yōu)镻RPA時，金屬β-內酰胺酶在其耐藥性上起到了重要作用。 第二部分：金屬β-內酰胺酶基因相關整合子分析及結合臨床資料對比研究 目的：1．研究金屬β-內酰胺酶是否

8、存在相關整合子；2．分析相關整合子類型；3．提供本院金屬酶整合子相關分子流行病學資料；4．結合臨床資料分析，以期給臨床有指導意義。 方法：1針對整合子基因上下游保守序列設計、合成引物，分段PCR法檢測整合子-基因盒系統(tǒng)在銅綠假單胞菌中的存在情況；2．利用金屬β-內酰胺酶基因引物和整合子可變區(qū)兩端保守區(qū)引物，進行整合子可變區(qū)的PCR-mapping和DNA測序，分析整合子-基因盒系統(tǒng)與會屬β-內酰胺酶的關聯性；3．結合產金屬β-內

9、酰胺酶PRPA相應病人資料結合耐藥譜、基因譜進行分析。 結果：1．PCR法共檢出7株PRPA均含有整合子，整合子攜帶率為100％(7/7)，上游長度約為1200bp，下游長度約為4，500bp；2．序列分析發(fā)現該序列與1999年日本發(fā)現的名為In31整合子有99％的同源性，IMP-1基因為該Ⅰ類整合子第一個基因盒；3．該7株PRPA均來自呼吸重癥監(jiān)護病房(RICU)慢性阻塞性肺疾病或外傷的病人，曾使用過大量廣譜抗生素，接受過機械