2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
已閱讀1頁(yè),還剩131頁(yè)未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、背景:
  近年來(lái),由于人口數(shù)量及流動(dòng)性增加、診治延誤和抗結(jié)核藥物的不規(guī)范使用,以及艾滋病等免疫缺陷病的流行,使得結(jié)核耐藥日趨嚴(yán)重,耐多藥結(jié)核(MDRTB)甚至廣泛耐藥結(jié)核(XDRTB)嚴(yán)重蔓延,嚴(yán)重危害社會(huì)公共衛(wèi)生安全。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,在全球22個(gè)結(jié)核及耐藥結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家中中國(guó)位列第二,耐藥結(jié)核感染率全球第一。對(duì)于耐藥結(jié)核患者,早發(fā)現(xiàn)、早治療是取得成功治療的關(guān)鍵。在制定治療方案時(shí),最好根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行個(gè)體化治療。對(duì)結(jié)核

2、分枝桿菌及其耐藥檢測(cè)的傳統(tǒng)方法,主要依靠痰涂片、培養(yǎng)、藥敏、PCR技術(shù)等多項(xiàng)試驗(yàn)綜合分析,方法繁瑣、需時(shí)長(zhǎng)、陽(yáng)性率低、特異性差,提供的耐藥信息量少;而目前基于耐藥基因檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù),如直接測(cè)序法、PCR-SSCP、微陣列基因芯片法等,價(jià)格昂貴,操作要求高。因此,建立新型檢測(cè)結(jié)核菌耐藥基因型的方法,用于快速檢測(cè)耐藥結(jié)核菌,對(duì)結(jié)核病早期治療和控制耐藥菌的傳播具有重要意義。
  表面等離子體共振(surfaceplasmonres

3、onance,SPR)傳感器是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的新型光學(xué)傳感器,其原理在于當(dāng)光在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時(shí),其對(duì)應(yīng)的入射角即SPR角與金屬表面結(jié)合的分子質(zhì)量成正比。它具有實(shí)時(shí)、無(wú)需標(biāo)記、在線分析等優(yōu)勢(shì),可通過(guò)換能器,將傳感器芯片表面配體與分析物作用的生物信號(hào)轉(zhuǎn)換為可檢測(cè)的光電物理信號(hào),實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中靶分子的檢測(cè)。在傳感器相關(guān)檢測(cè)中以PCR為代表的核酸擴(kuò)增技術(shù)常被用于提高檢測(cè)限。但由于復(fù)雜的熱循環(huán)過(guò)程帶來(lái)的非特異性擴(kuò)增、與芯片表面

4、擴(kuò)增的不兼容性以及增加的檢測(cè)成本,仍然是需要考慮的問(wèn)題。RCA是一種恒溫的DNA擴(kuò)增過(guò)程,可于短時(shí)間內(nèi)在固相載體表面擴(kuò)增出上千倍互補(bǔ)與環(huán)狀模板的串聯(lián)重復(fù)序列。與傳統(tǒng)PCR相比,RCA具有無(wú)需循環(huán)控溫、線性擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物易于固定等優(yōu)勢(shì),近年來(lái)成為一種新穎的信號(hào)擴(kuò)增工具用于DNA等痕量物質(zhì)的超敏檢測(cè)。恒溫連接酶的特異性使該方法對(duì)單堿基突變有較高的敏感度和分辨率,具有鏈置換活性的多聚酶使該擴(kuò)增反應(yīng)能在恒溫條件下進(jìn)行,且靶序列僅作為生成環(huán)狀模板

5、的支架,避免了可能的擴(kuò)增污染和潛在的生物危害。
  本研究結(jié)合課題組前期的研究基礎(chǔ),將芯片表面錨定RCA與SPR生物傳感技術(shù)相整合,建立了一種新型的恒溫?cái)U(kuò)增型SPR生物傳感器陣列,利用自行設(shè)計(jì)的標(biāo)簽型鎖式探針(PadlockProbe,PLP),可實(shí)現(xiàn)多重點(diǎn)突變的恒溫、高通量、無(wú)標(biāo)記檢測(cè)。并將其運(yùn)用于結(jié)核桿菌耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)的多重檢測(cè),可直接對(duì)結(jié)核桿菌核酸及其多重耐藥基因的5種常見(jiàn)突變位點(diǎn)進(jìn)行恒溫快速檢測(cè),為結(jié)核分枝桿菌及耐藥

6、基因快速鑒定和流行病學(xué)調(diào)查等提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
  方法:
  1.利用磁珠顆粒模擬固相反應(yīng)體系,根據(jù)生物配體的共價(jià)偶聯(lián)將氨基修飾的寡核苷酸探針(捕獲探針)固定于羧基修飾的磁珠表面構(gòu)成固相反應(yīng)生物敏感膜,探討固相RCA反應(yīng)的具體方式和最優(yōu)反應(yīng)體系。利用SRBR-GreenII對(duì)液相RCA擴(kuò)增體系進(jìn)行熒光定量觀察,以確定液相擴(kuò)增反應(yīng)的最佳體系。
  2.在前期研究基礎(chǔ)上,對(duì)SPR生物傳感器檢測(cè)平臺(tái)的硬件設(shè)施和軟件設(shè)施進(jìn)

7、行改進(jìn),增加檢測(cè)通道,改進(jìn)溫控和流速控制系統(tǒng)及分析物流通方式。對(duì)傳感器芯片自組裝相關(guān)方法進(jìn)行改進(jìn)并制備生物敏感膜。
  3.NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找針對(duì)四種臨床常用一線抗結(jié)核藥物的5種耐藥基因主要突變位點(diǎn)。利于PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)包含標(biāo)簽序列、通用序列、兩端識(shí)別序列的鎖式探針(PLP),并對(duì)形成的環(huán)狀探針進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析。利于ArrayDesigner4.0軟件,設(shè)計(jì)包含標(biāo)簽序列探針,使各探針間保持較好的一致性和特

8、異性。探討雜交時(shí)間、雜交溫度、擴(kuò)增時(shí)間等各項(xiàng)反應(yīng)條件對(duì)SPR信號(hào)值的影響,確定芯片表面RCA反應(yīng)的最佳條件。
  4.將納米金信號(hào)放大與固相表面錨定RCA反應(yīng)相結(jié)合,通過(guò)納米金顆粒修飾的通用序列探針與固相表面RCA反應(yīng)產(chǎn)物的大量串聯(lián)重復(fù)序列雜交,從而產(chǎn)生具有強(qiáng)大信號(hào)放大能力的聯(lián)級(jí)信號(hào)放大效果。優(yōu)化納米金信號(hào)放大系統(tǒng)的反應(yīng)條件,并以人工合成的模式DNA分子檢測(cè)該反應(yīng)系統(tǒng)的靈敏度和特異性。
  5.根據(jù)GenBank找到的結(jié)核分

9、枝桿菌16s-23srRNA基因ITS序列,設(shè)計(jì)包含硫代磷酸化修飾的酶切位點(diǎn)的鎖式探針,建立基于靶引物的液相RCA反應(yīng)鑒定結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌SPR生物傳感器檢測(cè)方法,并實(shí)現(xiàn)液相RCA反應(yīng)的無(wú)標(biāo)記實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
  6.以34例臨床標(biāo)本為檢測(cè)對(duì)象,針對(duì)四種一線抗結(jié)核藥物的五個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行MDRTB臨床標(biāo)本的SPR生物傳感器檢測(cè),并與測(cè)序結(jié)果對(duì)照;對(duì)建立的恒溫型SPR生物傳感器微陣列檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)比較和評(píng)估,并確定臨床樣本檢測(cè)步

10、驟。
  結(jié)果:
  1.完成以磁珠為載體的固相RCA體系構(gòu)建,并確定以液相連接后固相載體表面擴(kuò)增的方式進(jìn)行反應(yīng)。固相RCA的最佳反應(yīng)體系為0.5U/μLPhi29DNApolymerase,0.2μg/μLBSA,5%DMSO,1mMdNTPs。連接產(chǎn)物及RCA產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示,僅在突變型靶序列存在條件下生成的環(huán)狀模板可引發(fā)固相表面RCA反應(yīng),反之則無(wú)產(chǎn)物生成。
  2.成功構(gòu)建新型恒溫固相擴(kuò)增型SPR生物傳感器檢測(cè)

11、儀,傳感器芯片為20mmx28.6mm鍍金膜棱鏡,檢測(cè)流池為8通道串聯(lián)流通池。系統(tǒng)溫度控制范圍為25℃-60℃,溫控精度±0.1℃;流速范圍為5-2000μL/min,流速控制精度為±1μL/min;檢測(cè)池在反應(yīng)中能保持穩(wěn)定負(fù)壓,以保證系統(tǒng)反應(yīng)的穩(wěn)定性;采用巰基末端修飾共價(jià)結(jié)合法將還原型捕獲探針自組裝于芯片金膜表面,探針濃度為1μM。
  3.利用自行設(shè)計(jì)的鎖式探針可以完全分辨靶序列單堿基突變,RCA可將SPR信號(hào)值(突變位點(diǎn)信號(hào)

12、)放大10.0倍,突變識(shí)別率為5000:1(野生型與突變型靶序列的濃度比)。連接產(chǎn)物、RCA產(chǎn)物、以及RCA產(chǎn)物HhaI酶切電泳條帶位置準(zhǔn)確,明亮清晰。自行設(shè)計(jì)的捕獲探針特異性好、各探針之間具有相同的長(zhǎng)度和相近的Tm值(<1℃),可使各探針在相同條件下雜交,適于傳感器微陣列系統(tǒng)的多通道并行檢測(cè)。檢測(cè)最適液相靶序列雜交溫度為45℃,芯片表面雜交溫度為37℃,RCA擴(kuò)增時(shí)間為30min。
  4.針對(duì)5種臨床常見(jiàn)結(jié)核桿菌耐藥主要突變位

13、點(diǎn):異煙肼(INH):KatG315(AGC→ACC),inhA-15(ACG→ATG);利福平(PFP):rpoB526(CAC→TAC);乙胺丁醇(EMB):embB306(ATG→GTG);鏈霉素(SM):rpsL43(AAG→AGG),設(shè)計(jì)包含標(biāo)簽型鎖式探針及相應(yīng)捕獲探針的探針組,并實(shí)現(xiàn)了芯片表面各突變位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增檢測(cè),同一突變位點(diǎn)對(duì)突變型和野生型靶序列的SPR信號(hào)值差異明顯(p<0.01),各突變位點(diǎn)間交叉反應(yīng)結(jié)果顯示SPR

14、信號(hào)值差異明顯(p<0.01)。
  5.建立的納米金信號(hào)放大系統(tǒng)可有效提高檢測(cè)的靈敏度,直徑15nm的納米金顆粒在pH7.5和8%工作濃度下可將SPR信號(hào)值(RCA放大后)放大2.1倍,與陰性和空白對(duì)照信號(hào)值比較有顯著性差異(p<0.01)。對(duì)合成靶序列的檢測(cè)檢測(cè)限為5X10-12M(59.1±7.1mo),且在10-12M至10-8M濃度范圍內(nèi)成線性相關(guān)(y=615.29x+1323.8,R2=0.9846)。
  6.

15、建立的液相target-primedRCASPR生物傳感器檢測(cè)系統(tǒng),可通過(guò)兩步法在4h內(nèi)完成對(duì)結(jié)核分枝桿菌群復(fù)合群(MTBC)和鳥(niǎo)型分支桿菌群復(fù)合群(MAC)的恒溫(37℃)快速檢測(cè)。SPR方法對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果與菌種鑒定結(jié)果一致。最低檢測(cè)限分別為MTBC:4.2X104CFU/mL(0.005ng/μL),MAC:3.7x104CFU/mL(0.002ng/μL);經(jīng)特殊設(shè)計(jì)的鎖式探針可使液相RCA反應(yīng)與限制性內(nèi)切酶反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行,實(shí)

16、現(xiàn)無(wú)標(biāo)記的SPR實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)RCA反應(yīng)。
  7.采用試劑盒法和加熱堿裂解法對(duì)24例臨床分離株標(biāo)本和10例臨床分泌物樣本提取基因組DNA結(jié)果顯示,堿裂解法操作簡(jiǎn)便,對(duì)臨床分泌物標(biāo)本和臨床分離株均有較好的提取效果,可作為樣本的前處理方法。SPR傳感器方法檢測(cè)34例臨床標(biāo)本,檢測(cè)限為8.2pg/μL(65.7±8.5mo)臨床標(biāo)本基因組DNA,臨床靈敏度和特異性與測(cè)序方法比較分別katG315:92%和80%;inhA-15:100%

17、和100%;rpoB526:94.4%和100%;embB306:95%和100%;rpsL43:100%和100%。經(jīng)Kappa檢驗(yàn)兩種方法檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性性差異(p<0.05,Kappa>0.75)。
  結(jié)論:
  1.新型恒溫?cái)U(kuò)增型SPR生物傳感器,改變了普通高靈敏性傳感器檢測(cè)對(duì)PCR方法的依賴。其穩(wěn)定密閉的檢測(cè)系統(tǒng)和簡(jiǎn)單低耗能的操作,有利于傳感器的小型化和便攜性。
  2.自行設(shè)計(jì)的標(biāo)簽型鎖式探針,不

18、僅可在高背景干擾下識(shí)別突變靶序列,還可實(shí)現(xiàn)混合靶序列的多重連接反應(yīng)。其包含的標(biāo)簽序列,可實(shí)現(xiàn)芯片表面的多重固相擴(kuò)增反應(yīng),且反應(yīng)條件一致,交叉反應(yīng)小,增加了傳感器微陣列的檢測(cè)通量。
  3.納米金信號(hào)放大系統(tǒng)可顯著增加SPR芯片表面的等離子共振強(qiáng)度,有效提高傳感器的檢測(cè)靈敏度,為SPR生物傳感器的痕量物質(zhì)檢測(cè)提供了一種可靠的信號(hào)放大方法,在核酸非擴(kuò)增快速檢測(cè)及生物傳感器領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛力。
  4.基于靶引物的液相RCA型S

19、PR生物傳感器檢測(cè)系統(tǒng),在保證特異性與敏感性的基礎(chǔ)上,可快速恒溫地實(shí)現(xiàn)對(duì)液相擴(kuò)增反應(yīng)的無(wú)標(biāo)記實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),為核酸擴(kuò)增檢測(cè)提供了一條新思路。
  5.構(gòu)建的新型SPR生物傳感器檢測(cè)系統(tǒng),可在4小時(shí)內(nèi)同時(shí)檢測(cè)五種臨床常見(jiàn)MDRTB耐藥突變位點(diǎn),檢測(cè)方法具有靈敏、特異、操作簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)。與傳統(tǒng)基因芯片相比,極大降低了技術(shù)、設(shè)備要求和檢測(cè)成本。為臨床結(jié)核桿菌耐藥的恒溫快速檢測(cè)乃至其他基因檢測(cè)提供一種新方法新思路,有望彌補(bǔ)現(xiàn)有常規(guī)檢測(cè)方

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論