基于電化學(xué)及表面等離子體激元共振技術(shù)的生物傳感器研究.pdf

1、生物傳感涉及生物、化學(xué)、材料、物理、醫(yī)學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域。它是一種靈敏的、分子水平上的快速、微量的分析檢測方法。作為生物傳感器的重要分支,電化學(xué)生物傳感器具有諸多優(yōu)勢,如簡單、靈敏、易于獲得生物分子本身或反應(yīng)體系的電子傳遞過程,因而具有潛在、廣泛的應(yīng)用前景。然而,一些生物分子不具有電活性反應(yīng)中心,無法對其進(jìn)行直接檢測。電活性標(biāo)記物的引入,使那些本身不具有電活性或在電極表面電子傳遞速率較慢的生物分子(如DNA或蛋白質(zhì))的檢測成為可能。同時,納

2、米粒子的引入可顯著提高電化學(xué)方法的靈敏度。除電化學(xué)傳感器外,表面等離子體激元共振(SPR)光譜傳感器也是一種十分靈敏的生物傳感器。SPR傳感器可對基底表面極小的厚度及折射率變化產(chǎn)生靈敏的信號響應(yīng)。目前,SPR傳感器已被廣泛應(yīng)用于監(jiān)測諸如DNA雜交、DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合以及蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用等生命過程。基于上述考慮,本論文進(jìn)行了如下研究:
　　 一、采用巰基特異性試劑N-(2-乙基-二茂鐵)馬來酰亞胺(Fc—Mi)對表面固定的極

3、微量的多肽與靶點DNA進(jìn)行了檢測。所研究的多肽包括含有一個半胱氨酸殘基的谷胱甘肽(還原型與氧化型)以及含三個半胱氨酸殘基的六肽。采用循環(huán)伏安法對上述多肽分子中被Fc-Mi標(biāo)記的半胱氨酸殘基進(jìn)行了定量。結(jié)果表明:Fc-Mi電化學(xué)信號的大小與多肽中半胱氨酸殘基的數(shù)量成正比。該方法對靶點DNA的檢測具有極高的序列特異性,可區(qū)分單堿基錯配與四堿基錯配。靶點DNA的最低檢測量為10 fmol。
　　 二、采用雙功能交聯(lián)試劑4-馬來酰亞胺丁

4、酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(GMBS)將電活性的巰基二茂鐵(Fc-SH)基團(tuán)引入待檢測的蛋白質(zhì)(帶正電荷的溶菌酶(Lysozyme)與帶負(fù)電荷的金屬硫蛋白(MT))表面。聚電解質(zhì)的引入有效地降低了蛋白質(zhì)在電極表面的非特異性吸附。Fc-SH的電化學(xué)信號與通過靜電作用吸附在電極表面的蛋白質(zhì)濃度相關(guān)。溶菌酶的檢測限可低至0.1 nmol/L。該方法簡便、靈敏、重現(xiàn)性較好。
　　 三、采用電活性標(biāo)記物Fc-Mi檢測了由表面固定的一致性雙鏈D

5、NA所捕獲的野生型p53蛋白。p53蛋白表面的半胱氨酸殘基采用巰基特異性試劑Fc-Mi進(jìn)行衍生。野生型p53蛋白的鍵合水平與一致性雙鏈DNA的表面密度及序列相關(guān)。通過檢測Fc-Mi的電化學(xué)信號可以指示p53與一致性雙鏈DNA之間的特異性相互作用。該方法可檢測的野生型p53蛋白最低濃度為1.33 nmol/L,對臨床上p53蛋白質(zhì)的檢測具有一定的指導(dǎo)作用。
　　 四、通過Fc-SH覆蓋的納米金/抗生蛋白鏈菌素復(fù)合物進(jìn)行信號放大,采

6、用電化學(xué)手段檢測了表面固定的野生型p53蛋白。首先將含有一致性位點的雙鏈DNA固定在金電極表面,一致性雙鏈DNA捕獲溶液中的野生型p53蛋白,野生型p53蛋白表面的半胱氨酸殘基采用biotin-Mi進(jìn)行衍生,通過生物素-抗生蛋白鏈菌素的特異性相互作用將Fc-SH引入到電極表面。由于一個納米金表面可連接多個二茂鐵分子,該方法可檢測極低濃度的野生型p53蛋白(2.2 pmol/L)。采用上述方法對正常人及癌細(xì)胞溶胞液中野生型p53蛋白進(jìn)行了

7、檢測。結(jié)果表明,由于癌細(xì)胞中p53基因發(fā)生了突變,癌細(xì)胞中野生型p53蛋白質(zhì)的濃度大大降低。該方法簡便、靈敏、選擇性好且不需要p53抗體,具有一定的臨床應(yīng)用價值。
　　 五、采用雙通道表面等離子體激元共振技術(shù)對癌細(xì)胞溶胞液中的野生型以及突變型p53蛋白進(jìn)行了超靈敏的檢測。在其中一個SPR芯片表面固定一致性雙鏈DNA來捕獲溶液中的野生型p53蛋白,在另一個SPR芯片表面固定p53單克隆抗體來檢測p53蛋白的總量(野生型與突變型之和