表面等離子共振生物傳感器快速檢測點突變的新方法研究.pdf

1、近年來，單核苷酸多態(tài)性(SNPs)作為一類能夠在基因組DNA中穩(wěn)定遺傳的生物標記物被廣泛地應用于生物醫(yī)學研究的各個領域。研究表明，一些存在于基因編碼序列或調控區(qū)域的單堿基突變能夠導致基因功能的紊亂，從而影響個體對某些特定疾病的易感性和對藥物反應的差異性。因此，單堿基突變的檢測對于疾病的風險評估、臨床診斷和治療發(fā)揮著重要的作用，特別是對于一些遺傳性疾病的早期診斷以及指導個性化用藥意義重大。到目前為止，許多新興的方法已經被廣泛地應用于SNP

2、s的檢測，其中生物傳感器發(fā)展尤為迅速，特別是表面等離子共振(SPR)生物傳感器，已經發(fā)展成為了一種成熟的研究生物分子間相互作用的方法。SPR生物傳感器因其具有無需對分子進行標記、實時監(jiān)測動態(tài)反應過程、分析性能優(yōu)越、樣本用量少、易于自動化、檢測周期短等其他傳統(tǒng)方法所無法比擬的優(yōu)點，在核酸、多肽、蛋白質等生物分子測定方面顯示出了巨大的應用潛力。本研究將基因芯片技術、分子生物學技術與SPR傳感技術整合起來，利用了巰基自組裝以及DNA聚合酶對錯

3、配堿基的識別作用，原創(chuàng)性地提出了一種快速、簡便、實時、免標記、高靈敏的點突變檢測方法。本論文研究工作主要包括以下兩個部分:
　　1.表面等離子共振生物傳感平臺的構建
　　本實驗選用了BIACORE X分析系統(tǒng)和裸金芯片，采用分子自組裝技術在芯片金膜表面直接固定巰基修飾的捕獲探針構建用于檢測的傳感芯片。在金膜表面，巰基被氧化后形成金硫鍵，由于Au-S鍵之間的共價結合力很強，從而保證了配體在芯片表面固定的穩(wěn)定性。用6-巰基-1-

4、己醇(MCH)對芯片表面進行封閉，最大程度地減小非特異性吸附對響應信號的影響。實驗過程中，選擇70μl的進樣體積進行樣本分析，分別對2μl/min、5μl/min、7μl/min、10μl/min的樣本流速進行了優(yōu)化，考察了不同樣本流速對檢測信號的影響。該分析過程耗時較短，每次檢測僅需15分鐘。分別利用NaOH溶液和不同pH的Gly-HCl溶液對芯片表面進行再生，優(yōu)化再生條件，結果表明，芯片再生效果好，可重復使用30次以上。
　　

5、2.基于DNA聚合酶核酸延伸反應的單堿基突變的檢測
　　將第一部分所構建的SPR生物傳感器應用于聚合延伸反應產物的檢測，建立一種靈敏性高、特異性好的點突變檢測新方法。在液相反應中，利用DNA聚合酶對引物3'末端錯配構象的識別作用，在適宜的緩沖液和溫度條件下，以待測靶序列為模板進行核酸延伸反應，進而將反應產物注入Biacore X SPR系統(tǒng)中與芯片金膜表面修飾的捕獲探針進行雜交檢測。對引物延伸反應條件（Mg2+濃度、反應溫度、反應