基于噬菌體展示結(jié)合肽和納米探針的結(jié)核桿菌檢測新方法研究.pdf

1、目的：利用噬菌體展示隨機環(huán)七肽文庫進(jìn)行篩選獲得結(jié)核分枝桿菌MTB特異性結(jié)合肽，并初步鑒定其與MTB的結(jié)合能力；將篩選獲得的結(jié)合肽與納米磁珠和熒光量子點偶聯(lián)，建立免疫磁珠熒光量子點技術(shù)檢測MTB的新方法。
　　方法：噬菌體篩選以MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv滅活菌體為靶分子，按吸附、洗脫、擴增的生物淘選（簡稱淘選）過程對噬菌體展示隨機環(huán)七肽文庫進(jìn)行篩選，并于第2至第4輪的篩選中加入BCG滅活菌體進(jìn)行反篩，4輪淘選后，從滴度測定平板上各個方位

2、挑取H37Rv和BCG結(jié)合單噬菌體各28和27個進(jìn)行擴增純化，提取單鏈DNA進(jìn)行測序，間接ELISA法檢測不同單噬菌體與H3Rv、BCG和3種非分枝桿菌（銅綠假單胞菌、大腸桿菌和白色念珠菌）的結(jié)合活性，鑒定出陽性克隆。將陽性單噬菌體所表達(dá)的展示肽體外合成并標(biāo)記熒光，熒光顯微鏡觀察其與19種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的結(jié)合活性；流式細(xì)胞儀檢測四種合成環(huán)肽與H37Rv和BCG的結(jié)合活性。
　　利用濕化學(xué)方法制備納米磁珠和熒光量子點，將本室前期篩選

3、獲得的MTB特異性結(jié)合線性七肽H8以及購買的抗MTB多克隆抗體（Pab）偶聯(lián)納米磁珠，獲得2種免疫磁珠MNP-H8和MNP-Pab，將H8、抗MTB單克隆抗體（Mab）和抗MTB熱休克蛋白65單克隆抗體（Mabc）偶聯(lián)熒光量子點，獲得3種功能化熒光量子點QD-H8、QD-Mab和QD-Mabc，將免疫磁珠和功能化熒光量子點同時與MTB作用，形成三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)，通過激光誘導(dǎo)熒光儀測量熒光量子點的熒光值以及熒光顯微鏡觀察判定樣品中是否存在M

4、TB，建立免疫磁珠熒光量子點技術(shù)檢測MTB的新方法。將2種免疫磁珠和3種功能化熒光量子點配對組合，對六組組合的檢測下限和特異性進(jìn)行評估，初步篩選檢測MTB的最佳配體分子組合，利用最佳組合進(jìn)一步探討免疫磁珠和功能化熒光量子點的最佳工作濃度和最佳工作時間。利用H37Rv、田鼠分枝桿菌和11種NTM標(biāo)準(zhǔn)株菌懸液和模擬痰標(biāo)本以及3種非分枝桿菌（銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）標(biāo)準(zhǔn)株，對所建立檢測方法的檢測下限和特異度進(jìn)行初步評估。

5、>　　結(jié)果：經(jīng)過4輪淘選，能與靶分子特異性結(jié)合的噬菌體得到明顯富集。單噬菌體測序分析共獲得16種共同序列。間接ELISA檢測結(jié)果表明，單噬菌體SB1、SB5、SB8和SB26與H37Rv和BCG的親和力均較高（S/N≥2.1）確定為陽性克隆。熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果單噬菌SB1、SB5、SB8和SB26四種環(huán)肽均顯示出較高的親和特異性，可與線性肽H8組合用于MTB檢測。
　　濕化學(xué)方法合成的納米磁珠和熒光量子點顯微鏡下觀

6、察，均有較規(guī)則的形態(tài)和分散性。偶聯(lián)菌體結(jié)合肽H8的免疫磁珠和功能化熒光量子點均能與H37Rv結(jié)合，鏡下可見其與H37Rv作用的三元復(fù)合物，實驗組與對照組的熒光值比值約為4∶1。通過H37Rv不同稀釋度，田鼠分枝桿菌、11種NTM以及3種非分枝桿菌檢測，獲得最佳配體組合QD-H8與MNP-H8組合，免疫磁珠和功能化熒光量子點最佳工作濃度均為100μg/ml，最佳工作時間為2h。H37Rv菌懸液和模擬痰標(biāo)本的檢測下限均為103cfu/ml；

7、檢測11種NTM以及田鼠分枝桿菌時，顯微鏡觀察僅見偶發(fā)分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、金色分枝桿菌和副偶發(fā)分枝桿菌有紅色熒光，熒光值也僅此四種分枝桿菌為陽性；3種非分枝桿菌檢測結(jié)果均為陰性。
　　結(jié)論：利用噬菌體展示隨機肽庫技術(shù)淘選獲得與MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv有較高親和性及特異性的結(jié)合環(huán)肽；利用噬菌體展示肽與2種納米探針，成功建立免疫磁珠熒光量子點技術(shù)檢測MTB的新方法，檢測下限達(dá)到103cfu/ml，特異性較高，有可能為結(jié)核病的早期快速