結(jié)核分支桿菌耐異煙肼分子機(jī)理及其耐藥基因檢測(cè)方法的研究.pdf

1、異煙肼(INH)是主要的一線抗結(jié)核藥物之一，結(jié)核分支桿菌耐異煙肼直接影響化療的成功率。大量研究認(rèn)為，INH實(shí)際上是一種藥物前體，需經(jīng)結(jié)核分支桿菌過(guò)氧化氫酶—過(guò)氧化物酶氧化為尼克酸的類似物—異煙酸，參與輔酶Ⅰ的合成而發(fā)揮抗菌作用。結(jié)核分支桿菌katG基因含4795個(gè)核苷酸，編碼過(guò)氧化氫酶—過(guò)氧化物酶。若katG基因缺失或突變，使過(guò)氧化氫酶—過(guò)氧化物酶活性喪失或降低，阻止INH轉(zhuǎn)化成活性形式，就會(huì)導(dǎo)致結(jié)核分支桿菌耐INH。 目的：闡

2、明結(jié)核分支桿菌耐INH的分子機(jī)制及建立其耐藥基因的檢測(cè)方法。 方法：通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析方法對(duì)60株臨床分離株經(jīng)16SrRNA基因進(jìn)行初步的分子菌種鑒定，對(duì)58株結(jié)核分支桿菌進(jìn)行了傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(yàn)；以結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv做對(duì)照，通過(guò)PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)方法分析58株結(jié)核分支桿菌分離株katG273bp片段和inhA255bp片段；PCR直接測(cè)序法(PCR-DS)分析。

3、 結(jié)果：160株臨床分離株中2株為非結(jié)核分支桿菌，余58株為結(jié)核分枝桿菌，其圖譜均與結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SSCP圖譜相同。對(duì)58株結(jié)核分支桿菌進(jìn)行了傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果18株為INH敏感株，40株為耐INH菌株。對(duì)40株結(jié)核分支桿菌耐INH分離株和18株INH敏感株分別進(jìn)行katG和inhA基因擴(kuò)增，產(chǎn)生273bp和255bp片段。katG和inhA擴(kuò)增引物的敏感性均為100pg，特異性標(biāo)準(zhǔn)為結(jié)核分支桿菌復(fù)合群。 2

4、以結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv做對(duì)照，通過(guò)PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)方法分析58株結(jié)核分支桿菌分離株katG273bp片段和inhA255bp片段，其中18株INH敏感株中有5株(27.8％)出現(xiàn)katG擴(kuò)增產(chǎn)物泳動(dòng)變位，PCR直接測(cè)序法(PCR-DS)分析，1株315位AGC→AAC突變，4株315位AGC→ACC突變；18株INH敏感侏中有3株(16.7％)出現(xiàn)inhA泳動(dòng)變位。40株耐INH菌株中，29株(72.5％)k

5、atG基因SSCP圖譜與結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株不同，PCR-DS分析為katG315位AGC→ACC突變；10株(25％)inhA基因SSCP圖譜與標(biāo)準(zhǔn)株不同。對(duì)3株SSCP異常的INH敏感株和4株泳動(dòng)異常的耐INH結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行inhA基因PCR-DS分析，結(jié)果均為inhA基因-15位C→T突變。 3影響SSCP分析的因素很多，本文對(duì)PCR-SSCP方法的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，結(jié)果顯示采用8％(29∶1)非變性聚丙

6、烯酰胺凝膠在120V穩(wěn)壓下電泳6～8小時(shí)效果較理想。 結(jié)論：1.結(jié)核分支桿菌katG基因和inhA基因突變是耐INH產(chǎn)生的主要原因。 2.通過(guò)PCR-SSCP方法檢測(cè)結(jié)核分支桿菌臨床分離株，耐INH菌株中katG基因突變檢出率為72.5％，inhA基因突變檢出率為25％。 3.16SrRNAPCR-SSCP方法能夠簡(jiǎn)便、快速地將臨床分離株鑒定為結(jié)核分支桿菌復(fù)合群或非結(jié)核分支桿菌。 4.PCR擴(kuò)增結(jié)核分支桿