結(jié)核分支桿菌高特異性分子信標(biāo)設(shè)計(jì)及熒光芯片運(yùn)用的初步研究.pdf

1、目前對(duì)結(jié)核分支桿菌(Bacillus Tuberculosis，TB)的檢測(cè)，主要靠痰涂片、培養(yǎng)及PCR檢測(cè)等技術(shù)，存在耗時(shí)長(zhǎng)，敏感度低和特異性差等缺點(diǎn)，常常導(dǎo)致誤診和漏診，從而給病人帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此建立快速、敏感、簡(jiǎn)便的結(jié)核分支桿菌鑒定檢測(cè)系統(tǒng)是目前國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)急需解決的問題，也是有效治療和控制該類致病菌的有效手段之一。本研究通過自行設(shè)計(jì)結(jié)核分支桿菌高特異性的分子信標(biāo)，并以其為探針固定在芯片表面，從而將分子信標(biāo)探針的高靈敏

2、性、高特異性優(yōu)勢(shì)運(yùn)用于生物芯片領(lǐng)域，建立了一種快速鑒定結(jié)核分支桿菌的分子信標(biāo)探針熒光芯片技術(shù)，為結(jié)核分支桿菌流行病學(xué)調(diào)查提供了新的技術(shù)手段。 目的： 設(shè)計(jì)結(jié)核分支桿菌高特異性的分子信標(biāo)并構(gòu)建分子信標(biāo)探針型熒光芯片，建立快速鑒定結(jié)核分支桿菌的檢測(cè)技術(shù)。 方法： 1．根據(jù)GenBank找到結(jié)核分支桿菌基因序列，選擇序列號(hào)為IS986的基因序列，在Primer Premier V5.0軟件上設(shè)計(jì)結(jié)核分支桿菌特異

3、性引物。并對(duì)反應(yīng)體系中MgCl<,2>、引物、dNTP濃度以及引物退火溫度優(yōu)化后建立結(jié)核分支桿菌PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系。通過對(duì)TB標(biāo)準(zhǔn)株、TBI臨床分離株和臨床陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測(cè)序、靈敏性試驗(yàn)以及特異性試驗(yàn)對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行綜合評(píng)估。 2．從TB PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增片段內(nèi)部取一段序列設(shè)計(jì)，經(jīng)用beacon designer 2.1軟件分析設(shè)計(jì)分子信標(biāo)。對(duì)反應(yīng)體系中的分子信標(biāo)探針、MgCl<,2>、引物以及dNTP的濃度進(jìn)行

4、優(yōu)化后建立TB分子信標(biāo)直接加入PCR擴(kuò)增體系的雜交試驗(yàn)。 3．通過對(duì)雜交溫度、雜交時(shí)間以及雜交方式的優(yōu)化，建立PCR反應(yīng)后再加入TB分子信標(biāo)雜交試驗(yàn)。 4．運(yùn)用熒光分光光度計(jì)和熒光顯微鏡對(duì)MB PCR雜交產(chǎn)物熒光信號(hào)的觀測(cè)條件進(jìn)行摸索。并進(jìn)行不同熒光一淬滅分子對(duì)標(biāo)記分子信標(biāo)的觀測(cè)試驗(yàn)。 5．通過對(duì)傳統(tǒng)生物素(biotin)-親和素(avidin)連接方式和自行設(shè)計(jì)的單側(cè)延長(zhǎng)臂的分子信標(biāo)連接方式的對(duì)比研究，對(duì)TB分

5、子信標(biāo)與芯片固定方式進(jìn)行探索。 6．提高單側(cè)延長(zhǎng)臂的分子信標(biāo)芯片雜交效率部分優(yōu)化包括：5′寡核苷酸探針濃度；分子信標(biāo)探針濃度及純度；雜交溫度、雜交時(shí)間、雜交液配方；點(diǎn)樣大小與點(diǎn)樣濃度對(duì)熒光信號(hào)檢測(cè)的影響；陰一陽(yáng)性區(qū)分的臨界值。 7．TB-MB芯片的臨床應(yīng)用和方法學(xué)比較。 主要結(jié)果： 1．TB PCR反應(yīng)體系陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果為在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)245bp的條帶。MgCl<,2>、引物以及dNTP在TB PC

6、R體系中優(yōu)化后最佳終濃度分別為：4mmol/L、0.04μmol/L以及0.3 mmol/L。TB PCR體系的退火溫度優(yōu)化后為55℃。TB標(biāo)準(zhǔn)株及TB臨床分離株和臨床陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的序列完全一致。TB PCR反應(yīng)體系對(duì)其它細(xì)菌無交叉反應(yīng)。檢測(cè)限度為10拷貝/μl的DNA。 2．TB分子信標(biāo)直接加入PCR擴(kuò)增體系的TB分子信標(biāo)、MgCl<,2>、引物以及dNTP最佳終濃度分別為：0.04μm

7、ol/L、5.0mmol/L、0.04μmol/L、0.3mmol/L。 3．PCR反應(yīng)后再加入TB分子信標(biāo)雜交試驗(yàn)中水浴、PCR儀、恒溫?fù)u床的最適雜交溫度和適雜時(shí)間分別為：55℃，6h；55℃，4h；50℃，7h。陰-陽(yáng)性效果區(qū)分：水浴>恒溫?fù)u床>PCR儀。 4．熒光分光光度儀檢測(cè)MB PCR雜交陽(yáng)性產(chǎn)物、MB PCR雜交陰性產(chǎn)物(莖環(huán)結(jié)構(gòu)未打開)、無游離分子信標(biāo)探針PCR產(chǎn)物(空白對(duì)照)三者的熒光光亮度比值為：6.1

8、02/0.136/0.003。熒光顯微鏡觀測(cè)MB PCR雜交陽(yáng)性產(chǎn)物、MB PCR雜交陰性產(chǎn)物(莖環(huán)結(jié)構(gòu)未打開)熒光強(qiáng)度明顯區(qū)別。本試驗(yàn)Cy3-BDH組成分子信標(biāo)熒光-淬滅效率較Cy3-DABCLYE高，F(xiàn)AM-DABCLYE組成分子信標(biāo)熒光-淬滅效率較FAM-BDH高。 5．生物素-親和素(biotin-avidin)能很好的結(jié)合在芯片上但這種修飾有相當(dāng)技術(shù)難度；且生物素-親和素連接無特異性。本設(shè)計(jì)單側(cè)延長(zhǎng)臂分子信標(biāo)采用淬滅分

9、子中間標(biāo)記，莖結(jié)構(gòu)單側(cè)(淬滅分子一側(cè))延長(zhǎng)臂，能很好的結(jié)合在芯片上，且修飾技術(shù)難度低、特異性高。 6．單側(cè)延長(zhǎng)臂分子信標(biāo)芯片雜交效率的優(yōu)化結(jié)果：5′寡核苷酸探針最適濃度為40μmol/L。對(duì)較理想?yún)^(qū)分陰陽(yáng)性的信號(hào)強(qiáng)度：Cy3-BDH熒光-淬滅分子對(duì)標(biāo)記分子信標(biāo)探針濃度約10μmol/L，而FAM-DABCLYE分子對(duì)標(biāo)記分子信標(biāo)探針濃度約15μmol/L，經(jīng)65℃雜交17h有較好的雜交效果。Cy3-BDH分子信標(biāo)探針濃度約15μ

10、mol/L、FAM-DABCLE探針濃度約9μmol/L時(shí)雜交反應(yīng)達(dá)到7h可檢測(cè)到較強(qiáng)信號(hào)。雜交液的雜交結(jié)果比較：0.15％SDS效果好于0.2％SDS，10xSSC效果好于5xSSC。樣本隨著點(diǎn)樣直徑的縮小，熒光強(qiáng)度不變；樣本隨著點(diǎn)樣濃度的倍比減小，熒光強(qiáng)度也減小。 7．TB-MB芯片提痰標(biāo)本總檢出率為57.5％(23/40)，高于痰涂片27.5％(11/40)和培養(yǎng)35％(14/40)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理TB-MB芯片與痰涂片、培

11、養(yǎng)相比差異有顯著性(分別為x<'2>=7.366，P=0.006<0.01；x<'2>=32.281，P=0.000<0.01)。對(duì)照組20例，1例非結(jié)核分支桿菌病痰涂片、培養(yǎng)均陽(yáng)性，TB-MB芯片陰性；其余19例均為陰性。 結(jié)論： 1．TB-MB PCR反應(yīng)體系能夠快速對(duì)TB標(biāo)準(zhǔn)株、TB臨床分離株及臨床標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核分支桿菌的鑒別；相對(duì)普通PCR檢測(cè)具有更高的特異性和靈敏性，．為結(jié)核分支桿菌高特異性分子信標(biāo)熒光芯片的檢測(cè)

12、方法的建立奠定了基礎(chǔ)。 2．單側(cè)延長(zhǎng)臂分子信標(biāo)探針設(shè)計(jì)的發(fā)明及運(yùn)用，初步解決了分子信標(biāo)技術(shù)在芯片技術(shù)領(lǐng)域運(yùn)用的固定難題。巧妙地把分子信標(biāo)高特異性、高靈敏性等優(yōu)勢(shì)自然運(yùn)用到芯片技術(shù)上。 3．建立起結(jié)核分支桿菌分子信標(biāo)熒光芯片的檢測(cè)技術(shù)，包括樣本制備、芯片制備、雜交反應(yīng)以及掃描和圖像分析等方法。并兼顧到各種因素對(duì)單側(cè)延長(zhǎng)臂分子信標(biāo)芯片的影響，對(duì)反應(yīng)體系中各條件進(jìn)行了合理的優(yōu)化，使所建立的檢測(cè)體系穩(wěn)定可靠。 4．通過與