調(diào)控巨噬細胞自噬對結(jié)核分支桿菌清除作用的影響.pdf

1、目的：自噬(Autophagy)是廣泛存在于真核細胞中的生命現(xiàn)象,是生物在其發(fā)育、老化過程中都存在的一個凈化自身多余或受損細胞器以及維持細胞穩(wěn)態(tài)的共同機制,本實驗旨在通過對鼠肺原代巨噬細胞和活體動物實驗相結(jié)合的實驗方法來說明三甲基腺嘌呤,雷帕霉素調(diào)控巨噬細胞自噬對結(jié)核桿菌清除作用的影響,以證明白噬作用在細胞內(nèi)病原體清除中的地位。
　　 方法：分為體外實驗和體內(nèi)試驗兩部。第一部體外實驗:通過灌洗健康大鼠肺部,得到原代巨噬細胞后將細

2、胞分為四組:空白對照組,三甲基腺嘌呤組,雷帕霉素組,IFN-γ組(陽性對照組)。各組均用胎牛血清DMEM培基培養(yǎng)2天,再分別加入三甲基腺嘌呤60mg/L作用3小時；雷帕霉素50nmol/l作用36小時,IFN-γ400U作用3小時后再分別加入結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株1×lO^7 CFU/L共培育3小時,用PBS pH7.4緩沖液沖洗3次以洗脫未結(jié)合的H37Rv菌株,將沖洗液做熒光定量PCR檢測巨噬細胞吞噬后剩余結(jié)核分枝桿菌DNA濃度,

3、以檢測各組巨噬細胞清除結(jié)核桿菌的情況；第二部體內(nèi)試驗:將20只BALB/C小鼠(6周齡)隨機分為四組,分別腹腔注射:3-甲基腺嘌呤雷帕霉素 IFN-γ,空白組不注射后霧化感染結(jié)核桿菌。7w后脫頸椎處死,無菌條件下取肺組織分別做病理切片HE染色和抗酸染色,結(jié)核桿菌菌落計數(shù)以檢測結(jié)核桿菌在活體內(nèi)的清除情況。
　　 結(jié)果：⑴熒光定量PCR法檢測四組巨噬細胞吞噬后的結(jié)核桿菌,實時監(jiān)控雷帕霉素組與IFN-γ組(陽性對照組)結(jié)核桿菌數(shù)量明顯

4、低于空白對照組和三甲基腺嘌呤組。比較雷帕霉素組與IFN-γ,組(陽性對照組)分別和空白對照組,三甲基腺嘌呤組之間差異有統(tǒng)計學意義,空白對照組和三甲基腺嘌呤組之間差異也有統(tǒng)計學意義。⑵肺組織病理切片兩種染色結(jié)果均顯示雷帕霉素組與IFN-γ組(陽性對照組)肺組織病理變化明顯輕于空白組和三甲基腺嘌呤組。⑶肺組織均漿液結(jié)核桿菌菌落計數(shù)顯示雷帕霉素組和IFN-γ組(陽性對照組)菌落計數(shù)最少且雷帕霉素組與IFN-γ組(陽性對照組)分別和空白對照組,