維生素D誘導自噬對巨噬細胞清除結核分枝桿菌的作用的實驗研究.pdf

1、目的：機體內巨噬細胞(macrophage， Mφ)與結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis， Mtb)的相互作用影響著結核?。╰uberculosis，TB）的發(fā)展方向，增強Mφ對胞內Mtb的殺滅能力成為治療 TB和減少發(fā)病的重要策略。維生素D通過與維生素D受體（Vitamin Dreceptor，VDR）的結合，對誘導Mφ自噬以及自噬溶酶體的成熟發(fā)揮著關鍵調節(jié)作用。本課題旨在研究維生素D誘導巨噬細胞產生自

2、噬并清除巨噬細胞內Mtb的作用。
　　方法：(1)建立Mφ感染Mtb的體外模型：使用豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol12-myristate13-acetate，PMA)誘導人單核巨噬細胞系U937分化，使之具有吞噬能力，分化后的 U937細胞經 Mtb標準人型毒力株H37Rv處理，建立 Mφ感染 Mtb的體外模型。(2)實驗分組：分化的U937細胞隨機分為：陰性對照組（RPMI1640培養(yǎng)基，24小時）、維生素D組[100pM1

3、,25（OH）2D3，24小時]、自噬抑制劑+維生素D組[10μM3-甲基腺嘌呤（3-methyl adenine，3-MA）+100pM1,25（OH）2D3，24小時]、陽性對照組（10nM雷帕霉素，18小時），各組細胞以H37Rv感染（細菌：細胞=10：1）4小時。（3）檢測相關指標：感染后第4天，利用臺盼藍染料排斥試驗評價藥物的細胞毒性。半定量RT-PCR檢測自噬相關基因（autophagy-related genes，Atg）

4、Atg5、Beclin-1及人抗菌肽LL-37、微管相關蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain3，LC3）B mRNA的表達。Western Blotting檢測LL-37、LC3B-Ⅱ蛋白的表達。分別計數感染后第1、4天細胞內Mtb的菌落形成單位(colony forming units， cfu)。流式細胞術計數感染后第4天LC3B-Ⅱ+和/或結核分枝桿菌抗原85A+（Ag

5、85A+）的細胞數。
　　結果：(1)實驗中臺盼藍染料排斥試驗顯示細胞存活率均達96％以上；(2)與對照組相比，半定量 RT-PCR檢測發(fā)現維生素 D組 Atg5、Beclin-1、LL-37、LC3B mRNA的表達增強（ P＜0.01）；(3)Western Blotting檢測發(fā)現維生素 D組 LL-37蛋白的表達增加（P＜0.01）及LC3B-Ⅱ蛋白的表達增加（P＜0.05）；(4)感染后第1天維生素 D組細胞內Mtb的菌

6、落數無明顯改變（P＞0.05），而感染后第4天維生素D組細胞內 Mtb的菌落數顯著減少（P＜0.01）；(5)與陰性對照組比較，流式細胞術顯示維生素D組LC3B-Ⅱ+-細胞增多，Ag85A+-細胞減少，且 LC3B-Ⅱ+-Ag85A--細胞增加（維生素 D組65.1%比陰性對照組2.22%）；(6)與維生素D組相比，在自噬抑制劑3-MA+維生素D組中，不但Atg5、Beclin-1、LC3B的mRNA表達受到抑制，LL-37的mRNA表