Ipr1基因在巨噬細胞抗結核分枝桿菌感染中的作用與機制的實驗研究.pdf

1、本課題從C57BL/6J小鼠的胸腺組織通過RT-PCR法獲得Iprl(intracellular pathogen resistance 1，細胞內(nèi)病原體抗性基因1)基因全長編碼序列，克隆入真核表達載體，體外轉染小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞，并在轉錄水平及翻譯水平鑒定了Iprl基因的表達，并確定了Iprl基因表達產(chǎn)物的細胞內(nèi)定位。觀察了Iprl基因的表達對巨噬細胞生長狀態(tài)的影響及巨噬細胞體外抗分枝桿菌H37Ra感染活性的影響。運用

2、基因芯片技術檢測Iprl基因的表達與巨噬細胞抗Mtb感染的免疫應答機制中的相關因素之間相互關系，初步探討了Iprl基因在巨噬細胞抗Mtb感染中的作用機制。 第一部分 Iprl基因的獲取及原核表達載體的構建和表達 目的：獲取Iprl基因全長編碼序列，構建Iprl基因原核表達載體，轉化大腸桿菌，誘導重組蛋白表達，制備抗Iprl多克隆抗體。 方法：從C57BL/6J小鼠胸腺組織提取總RNA，以RT-PCR法調(diào)取Iprl

3、基因編碼序列，上下游引入BamHⅠ、PstⅠ酶切位點，克隆至pMD19-T simple載體中獲得重組質(zhì)粒pMD19-T simple-Iprl，轉化大腸桿菌JM109，篩選的陽性克隆作PCR及酶切鑒定后測序分析。其中的突變堿基經(jīng)點突變修復，測序正確后獲得含正確Iprl序列的重組質(zhì)粒﹡pMD19-T simple-Iprl。將Iprl基因亞克隆于原核表達載體pQE30，獲得原核表達質(zhì)粒pQE30-Iprl；以重組質(zhì)粒﹡pMD19-T s

4、imple-Iprl為模板，PCR法擴增Iprl基因，上下游分別引入Kpn I、BamH I酶切位點，構建另一原核表達質(zhì)粒pET32a(+)-Iprl。將pQE30-Iprl轉化表達菌株SG13009、M15；pET32a(+)-Iprl轉化表達菌株BL21、BL21(pLyS)，IPTG誘導目的基因的表達，SDS-PAGE鑒定重組蛋白表達情況。 結果：從C57BL/6J小鼠胸腺組織內(nèi)擴增出大小為1338bp片段。陽性克隆測序鑒

5、定發(fā)現(xiàn)一個點突變，經(jīng)點突變修復后與GenBank報道的Iprl基因序列一致。亞克隆獲得重組原核表達質(zhì)粒pQE30-Iprl經(jīng)酶切鑒定正確，構建的另一原核表達質(zhì)粒pET32a(+)-Iprl經(jīng)測序鑒定正確。pQE30-Iprl、pET32a(+)-Iprl分別在其相應表達菌株IPTG誘導表達，均未成功表達出Iprl重組蛋白。 結論：成功獲取小鼠Iprl基因全長編碼序列并成功構建含Iprl基因的兩種原核表達質(zhì)粒pQE30-Iprl、

6、pET32a(+)-Iprl，但Iprl基因原核表達獲取重組蛋白未獲成功，提示Iprl基因原核表達可能有一定難度。 第二部分 目的：構建小鼠Iprl基因與EGFP基因融合表達載體，鑒定Iprl基因在小鼠巨噬細胞株RAW264.7中的表達及細胞內(nèi)定位。 方法：限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、BαmHⅠ雙酶切重組原核表達質(zhì)粒pET32a(+)-Iprl及真核表達載體pEGFP-C1，獲得的Iprl基因片段與pEGFP-C1載體

7、大片段連接后獲得真核表達質(zhì)粒pEGFP-Iprl，經(jīng)PCR、酶切鑒定正確后，脂質(zhì)體瞬時轉染pEGFP-Iprl至小鼠巨噬細胞株RAW264.7，以空質(zhì)粒pEGFP-C1轉染組作為對照。采用RT-PCR法、Western blotting法分別在轉錄水平及翻譯水平檢測Iprl基因的表達及用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的表達及細胞內(nèi)定位。 結果：成功構建了重組真核表達質(zhì)粒pEGFP-Iprl，瞬時轉染小鼠巨噬細胞株RAW

8、264.7，經(jīng)RT-PCR、Western-blotting鑒定Iprl基因在轉錄水平及翻譯水平獲得表達，Iprl基因編碼產(chǎn)物分子量大約50kD左右，熒光顯微鏡及共聚焦顯微鏡觀察Iprl融合綠色熒光蛋白表達產(chǎn)物定位于細胞核內(nèi)。 結論：成功構建了Iprl基因與EGFP基因融合表達質(zhì)粒pEGFP-Iprl，成功轉染小鼠巨噬細胞株RAW264.7，在轉錄及翻譯水平檢測到Iprl基因表達，Iprl基因表達產(chǎn)物定位于細胞核內(nèi)。 第

9、三部分 Iprl基因表達對小鼠巨噬細胞株RAW264.7生長的影響及殺傷分枝桿菌作用的研究 目的：觀察Iprl基因表達對小鼠巨噬細胞株RAW264.7的生長狀態(tài)的影響，以及Iprl基因的表達對小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞體外殺傷結核分枝桿菌H37Ra作用的影響。 方法：1.采用脂質(zhì)體瞬時轉染的方法將Iprl基因真核表達質(zhì)粒pEGFP-Iprl轉染小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞，同時轉染空質(zhì)粒pEGFP-C1作為

10、對照組，應用MTT法檢測Iprl基因的表達對巨噬細胞的生長是否有抑制作用；應用TUNEL原位凋亡檢測Iprl基因表達對巨噬細胞是否有致凋亡作用。2.應用G418壓力篩選穩(wěn)定表達Iprl基因的小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞，獲得高表達Iprl基因的巨噬細胞(實驗組細胞)，同時篩選空質(zhì)粒pEGFP-C1轉染穩(wěn)定表達GFP的細胞(對照組細胞)。3.體外感染分枝桿菌H37Ra，感染后24h及96h細胞裂解物細菌培養(yǎng)菌落計數(shù)(CFU)的方法觀

11、察實驗組細胞(Iprl+)、對照組細胞(Iprl-)抗結核分枝桿菌H37Ra感染活性。 結果：1.MTT法檢測未發(fā)現(xiàn)Iprl基因的表達對小鼠巨噬細胞株RAW264.7有抑制生長的作用；TUNEL原位凋亡檢測結果末發(fā)現(xiàn)Iprl基因的表達對小鼠巨噬細胞株RAW264.7有促凋亡的作用。2.經(jīng)G418壓力篩選后獲得穩(wěn)定表達Iprl基因的RAW264.細胞及空GFP表達的RAW264.細胞。3.細胞水平抗分枝桿菌H37Ra實驗結果顯示Ip

12、rl基因的表達的實驗組巨噬細胞裂解物細菌培養(yǎng)菌落計數(shù)(CFU)低于對照組細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。 結論：Iprl基因的表達產(chǎn)物對巨噬細胞的增殖無抑制作用，也不引起巨噬細胞凋亡。G418壓力篩選出高表達Iprl基因的細胞。體外抗菌實驗表明Iprl基因的表達增強了巨噬細胞殺傷胞內(nèi)吞噬的結核分枝桿菌H37Ra的能力。 第四部分基因芯片初步探討Iprl基因的表達對巨噬細胞結核抗分枝桿菌感染免疫應答的影響

13、 目的：應用小鼠固有免疫及適應性免疫應答功能分類cDNA芯片檢測Iprl基因在巨噬細胞的表達對感染結核分枝桿菌H37Ra的巨噬細胞抗感染免疫應答相關機制的影響及相互關系。 方法：實驗組(Iprl+)巨噬細胞RAW264.7與對照組(Iprl-)巨噬細胞RAW264.7分別感染結核分枝桿菌H37Ra，于感染96h后分別提取兩組的總RNA，逆轉錄合成cDNA及線性生物素標記的cRNA，純化cRNA后與小鼠固有免疫及適應性免疫應答功能

14、分類基因芯片(113個基因位點)雜交，應用化學發(fā)光檢測基因芯片雜交結果，采集圖像經(jīng)軟件分析得到基因表達差異的結果。應用實時定量PCR法對芯片結果中上調(diào)的3個基因檢測以驗證芯片結果的可靠性。 結果：基因芯片結果經(jīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)Iprl基因的表達上調(diào)了11個巨噬細胞抗Mtb固有免疫機制中的有關分子的基因轉錄，其中與巨噬細胞抗Mbt感染關系密切的基因有：參與TLRs信號通路的分子：TLR2、TLR4、Irak1、Traf6，以及干擾素相

15、關基因：Ifngr1(IFN-γR1)和腫瘤壞死因子相關基因：Tnfrsfla(TNFR1)。而巨噬細胞參與調(diào)節(jié)適應性免疫應答相關的分子的基因表達如：IL-1、TNF-α、IL-12等表達無明顯差異。對于3個表達下調(diào)的基因Clecsf12、Illrap、Ltf由于其標準值較低(＜0.05)，其準確度較低，可能意義不大。經(jīng)定量PCR反應對TLR2、TLR4及Ifngr1的檢測結果與芯片結果分析表明定量PCR結果與芯片結果趨勢一致。