傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞自噬通量的影響和作用時(shí)相的研究.pdf

1、目的：
　　研究傷寒沙門(mén)菌（Salmonella enterica serovar typhi, S.typhi）質(zhì)粒pRST98對(duì)巨噬細(xì)胞自噬動(dòng)態(tài)過(guò)程的影響，探討該質(zhì)粒與沙門(mén)菌感染時(shí)巨噬細(xì)胞自噬體及自噬溶酶體的關(guān)系，揭示pRST98對(duì)自噬通量（autophagic flux）的作用時(shí)相，為通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬水平來(lái)防治細(xì)菌感染的新策略及新藥研發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　一、傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的影響<

2、br>　　以攜帶 pRST98的傷寒沙門(mén)菌野生株 ST8，消除 pRST98的傷寒沙門(mén)菌突變株ST8-ΔpRST98和將 pRST98經(jīng)接合轉(zhuǎn)移重新導(dǎo)入 ST8-ΔpRST98所獲得的回補(bǔ)株ST8-c-pRST98，按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）100:1感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞J774A.1，建立細(xì)胞感染模型，同時(shí)設(shè)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（rapamycin，RAPA）干預(yù)組。分別于細(xì)胞感染后1~3

3、h收集細(xì)胞，透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）和免疫印跡法（western blot，WB）檢測(cè)自噬蛋白LC3-II、Beclin-1的表達(dá)；用紅色和綠色熒光蛋白偶聯(lián)的LC3真核細(xì)胞表達(dá)載體mRFP-GFP-LC3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，共聚焦激光顯微鏡（confocal laser scanning microscope，C

4、LSM）觀察LC3-II點(diǎn)狀聚集，并用免疫組化法做平行對(duì)照；平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)胞內(nèi)活菌數(shù)（colony-forming unit， CFU）。
　　二、傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞自噬通量及作用時(shí)相的影響
　　由于傷寒沙門(mén)菌的嚴(yán)格宿主特異性，使其缺乏理想的動(dòng)物模型，為今后進(jìn)一步在動(dòng)物活體內(nèi)研究pRST98與細(xì)胞自噬的關(guān)系，本部分實(shí)驗(yàn)用與傷寒沙門(mén)菌有非常近緣關(guān)系的鼠傷寒沙門(mén)菌作為研究對(duì)象，研究該質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞自噬通量的影響。以攜帶

5、一分子量為100 kb毒力質(zhì)粒的鼠傷寒沙門(mén)菌（Salmonella enterica serovar typhimurium，S.typhimurium）標(biāo)準(zhǔn)毒株χ3306、將其質(zhì)粒消除后獲得的鼠傷寒沙門(mén)菌突變株χ3337和將質(zhì)粒pRST98經(jīng)接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入χ3337后形成的鼠傷寒沙門(mén)菌接合子χ3337/pRST98為受試菌，同第一部分建立感染模型。分別設(shè)饑餓誘導(dǎo)組（無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液處理細(xì)胞）、溶酶體抑制劑氯喹（chloroq

6、uine，CQ）干預(yù)組和常規(guī)細(xì)胞感染模型組。于感染后1 h收集細(xì)胞，用Giemsa染色法觀察各感染組細(xì)胞狀態(tài)及感染情況；CLSM觀察轉(zhuǎn)染mRFP-GFP-LC3的巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白LC3-II的點(diǎn)狀聚集；WB檢測(cè)自噬標(biāo)記蛋白 LC3-II及自噬底物蛋白 p62的表達(dá)；將熒光素酶報(bào)告基因 lux導(dǎo)入以上3株受試菌染色體，獲得發(fā)光菌χ3306lux、χ3337lux及χ3337/pRST98lux，用小動(dòng)物成像儀檢測(cè)相應(yīng)細(xì)菌的生物發(fā)光量，直

7、接分析感染細(xì)胞內(nèi)CFU。
　　結(jié)果：
　　一、傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的影響
　?。?）TEM結(jié)果顯示，感染后1~3 h，ST8-ΔpRST98感染組細(xì)胞中可觀察到典型的自噬體和自噬溶酶體；ST8和ST8-c-pRST98感染組少見(jiàn)或未見(jiàn)到上述結(jié)構(gòu)，但可見(jiàn)大量細(xì)菌的存在。
　　（2）CLSM檢測(cè)LC3點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，感染后1 h，ST8-ΔpRST98感染組細(xì)胞內(nèi)LC3點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯高于ST8和ST8

8、-c-pRST98感染組（p<0.05）；RAPA干預(yù)后，ST8和ST8-c-pRST98感染組細(xì)胞內(nèi)點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)均有增加（p<0.05），但各感染組之間無(wú)顯著差異。
　?。?）FCM和WB檢測(cè)結(jié)果顯示，感染后1 h，ST8和ST8-c-pRST98感染組細(xì)胞自噬蛋白LC3-II和Beclin-1的表達(dá)量均低于ST8-ΔpRST98感染組（p<0.05）；RAPA干預(yù)后，ST8和ST8-c-pRST98感染組LC3-II、Beclin

9、-1的表達(dá)量均增加（p<0.05），但各感染組之間無(wú)顯著差異。
　?。?）平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)胞內(nèi)CFU結(jié)果顯示，感染后1 h，ST8和ST8-c-pRST98感染組胞內(nèi)CFU高于ST8-ΔpRST98感染組（p<0.05）；RAPA干預(yù)后，趨勢(shì)不變。感染后3 h，RAPA干預(yù)的ST8和ST8-c-pRST98感染組胞內(nèi)CFU減少均低于未干預(yù)組（p<0.05），而ST8-ΔpRST98感染組未見(jiàn)顯著變化。
　　二、傷寒沙門(mén)菌質(zhì)

10、粒對(duì)巨噬細(xì)胞自噬通量及作用時(shí)相的影響
　　（1）Giemsa染色結(jié)果顯示，感染后1 h，常規(guī)感染組細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)或少見(jiàn)空泡，所見(jiàn)空泡內(nèi)常包裹細(xì)菌；CQ干預(yù)后，細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)均勻空泡，細(xì)胞略有腫脹，各感染組胞內(nèi)細(xì)菌增多；饑餓誘導(dǎo)下，巨噬細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)不均勻的空泡，胞內(nèi)細(xì)菌量低于未誘導(dǎo)組。
　?。?）CLSM檢測(cè)結(jié)果顯示，感染后1 h，χ3337感染組細(xì)胞內(nèi)黃色熒光聚集結(jié)構(gòu)（自噬體）多于χ3306和χ3337/pRST98感染組，CQ干預(yù)

11、后黃色熒光差異更加顯著；紅色熒光聚集結(jié)構(gòu)（自噬溶酶體）則未見(jiàn)明顯差異；饑餓誘導(dǎo)后，χ3337感染組平均每個(gè)細(xì)胞中自噬體顯著多于χ3306和χ3337/pRST98感染組（p<0.01），自噬溶酶體各感染組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　（3）WB檢測(cè)結(jié)果顯示，感染后1 h，χ3337感染組細(xì)胞LC3-II表達(dá)量高于χ3306和χ3337/pRST98感染組，而p62表達(dá)量則低于后兩組；CQ干預(yù)后，各組感染細(xì)胞LC3-II表達(dá)差異與常規(guī)感染

12、模型一致，即χ3337感染組細(xì)胞高于χ3306和χ3337/pRST98感染組，但差異更加顯著，p62表達(dá)水平各感染組間差異不顯著。
　?。?）小動(dòng)物成像儀檢測(cè)胞內(nèi)CFU結(jié)果顯示，感染后1 h，χ3306和χ3337/pRST98感染組胞內(nèi)CFU顯著高于χ3337感染組（p<0.05）；CQ干預(yù)后，各感染組胞內(nèi)CFU無(wú)顯著差異。饑餓誘導(dǎo)后，χ3306和χ3337/pRST98感染組胞內(nèi)CFU均低于未誘導(dǎo)對(duì)照組（p<0.01）。