分枝菌酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型的建立及其對(duì)自噬功能的影響.pdf

1、目的:
　　1.建立分枝菌酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型，探討分枝菌酸包被聚苯乙烯微球誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞化的條件及特性。
　　2.建立穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-LC3B的RAW264.7細(xì)胞模型。
　　3.探討分枝菌酸所致巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞化對(duì)細(xì)胞自噬功能的影響。
　　方法:
　　1.將RAW264.7細(xì)胞分為空白對(duì)照組和分別包被0、25、50、75、100μg/mL分枝菌酸的聚苯乙烯微球?qū)嶒?yàn)

2、組，分別將細(xì)胞與聚苯乙烯微球混勻，共同孵育24、48、72 h、5d和8d后，油紅O染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，采用總膽固醇試劑盒和游離膽固醇試劑盒測(cè)定各組泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的含量，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平。
　　2.以RT-PCR法擴(kuò)增小鼠LC3B基因，雙酶切后插入真核表達(dá)載體pEGFP-C1中，構(gòu)建pEGFP-LC3B重組質(zhì)粒。
　　3.經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定后，將pEGFP-LC3B重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染小鼠巨噬

3、細(xì)胞RAW264.7，經(jīng)G418壓力篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆并將其擴(kuò)大培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。
　　4.將細(xì)胞分為三組，分別為空白R(shí)AW264.7細(xì)胞組、pEGFP-LC3B/RAW264.7細(xì)胞組以及用75μg/mL MA誘導(dǎo)5d的pEGFP-LC3B/RAW264.7細(xì)胞組。RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中Becn1及LC3B mRNA轉(zhuǎn)錄水平，Western-blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的比值變化。
　　

4、結(jié)果:
　　1.當(dāng)包被分枝菌酸濃度為75μg/mL、吞噬時(shí)間為24h時(shí)，RAW264.7能形成典型的泡沫細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯相對(duì)含量為60.98％±1.32％;隨著吞噬時(shí)間延長(zhǎng)，形成泡沫細(xì)胞所需的分枝菌酸的濃度逐漸遞減;且隨著細(xì)胞泡沫化程度增加，細(xì)胞增殖活力逐漸減弱。
　　2.經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定，pEGFP-LC3B重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　3.將pEGFP-LC3B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)G418加壓篩選

5、后獲得了表達(dá)綠色熒光蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。
　　4.與對(duì)照組相比，RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)成為泡沫細(xì)胞后其Becn1基因轉(zhuǎn)錄水平和LC3B表達(dá)水平降低，蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的比值降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建分枝菌酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。分枝菌酸包被聚苯乙烯微球可快速誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，分枝菌酸濃度與細(xì)胞泡沫化程度呈正相關(guān)，且呈時(shí)間依賴性。
　　2.成功構(gòu)建p