香芹酚對巨噬細胞泡沫化的影響及其在RASMCs中的自噬機制研究.pdf

1、研究目的:
　　動脈粥樣硬化是一種進行性疾病，其特征是脂類的積累和大動脈血管纖維元素。慢性炎癥在動脈粥樣硬化的發(fā)展起著重要的作用。激活的白細胞、內皮細胞和巨噬細胞產生促炎細胞因子包括IL-1β，IL-6、以及TNF-α以及抗炎細胞因子，如IL-10。從中草藥、植物中尋找有效且毒副作用反應小的抗動脈粥樣硬化的藥物靶點，可成為新世紀國內外學者研發(fā)抗血脂藥物的新方向。已證實香芹酚具有多方面的藥理特性且對人體正常細胞毒性最小。已有多項實驗

2、研究表明香芹酚具有抗炎、抗動脈粥樣硬化內膜增生的作用。但具體的作用機制尚未清楚。本研究探索香芹酚對(ox-LDL)誘導細胞自噬的影響，并初步探討其可能的分子機制。
　　研究方法:
　　1、體外培養(yǎng)氧化低密度脂蛋白誘導的TPH-1細胞成泡沫細胞，然后用不同濃度的香芹酚(終末濃度為0.1、1.0、5.0、10 uM)處理巨噬細胞RAW246.7細胞24 h，檢測隨著香芹酚的濃度的增加觀察其抗增殖效應和誘導凋亡效應。
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3、HP-1細胞采用PRMI-1640培養(yǎng)基和10％無支原體新生小牛血清作為補充培養(yǎng)液，置于37'C、5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期細胞進行實驗，實驗前用100nM佛波醋(PMA)培育THP-1細胞24h，使其誘導分化成巨噬細胞，更換培養(yǎng)基后加不同濃度梯度的Ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)48h，使其轉化成泡沫細胞。
　　2、觀察香芹酚對氧化低密度脂蛋白誘導的TPH-1細胞成泡沫細胞的凋亡作用.Hoechst33258染色法檢測RAW24

4、6.7細胞增殖凋亡。分別使用P38-MAPK信號通路特異性阻抗劑SB203580阻斷P38-MAPK信號通路和ERK/MAPK信號通路特異性阻斷劑U0216阻斷ERK/MAPK信號通路，檢測細胞的活性和表達關系。實驗分組如下:
　　(1)香芹酚作用組:分別以不同組分香芹酚作用RAW264.7細胞24，48 h，設空白對照組和藥物組，觀察香芹酚對RAW264.7細胞炎癥定性率及穩(wěn)定性蛋白的影響;通過Western Blot在RAW2

5、64.7細胞中15分鐘檢測香芹酚對磷酸化蛋白質及其總蛋白表達的MAPK信號通路的影響。
　　(2)抑制劑組:分別以20 MU0126A(ERK1/2特異性抑制劑)及10MSB203580B(P38特異性抑制劑)作用RAW264.7細胞48，24 h，空白對照是以相應條件下不加抑制劑的RAW264.7細胞，觀察其對RAW264.7細胞炎癥及斑塊穩(wěn)定性形態(tài)的影響。
　　(3)香芹酚和抑制劑聯(lián)合組:為觀察特異性抑制MAPK信號轉導

6、通路對香芹酚抑制RAW264.7細胞炎癥影響。用5uM香芹酚，10 M U0126及10 M SB203580聯(lián)合作用于RAW264.7細胞24h，抑制劑提前于香芹酚1h加入。
　　3、通過油紅0染色顯示細胞內脂滴的狀態(tài)，檢測香芹酚抑制泡沫細胞形成
　　細胞接種于培養(yǎng)板內，oxldl誘導建模成功后，檢測不同香芹酚濃度抑制泡沫細胞水平。
　　4、觀察香芹酚是否抑制ox-LDL誘導的LOX-1表達
　　取細胞的總RN

7、A進行RT-PCR，檢測不同濃度Carvacrol組LOX-1蛋白水平。
　　5、Western Blot法分析香芹酚對氧化低密度脂蛋白誘導的TPH-1細胞成泡沫細胞泡沫化中凋亡及NFkB蛋白的各種磷酸化形式
　　Western Blot法包括1、灌膠與上樣2、電泳3、轉膜4、封閉5、免疫反應
　　6、觀察香芹酚抑制Ox-LDL誘導的炎癥因子
　　分別以香芹酚1uM，5uM，10uM三個濃度梯度的Carvacro

8、l處理Ox-LDL作用下THP-1巨噬細胞48小時后，用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-a、 IL6、 IL-1beta。
　　7、觀察香芹酚對氧化低密度脂蛋白誘導的細胞自噬的影響。通過電鏡檢測及WesternBIot檢測其香芹酚對氧化低密度脂蛋白誘導的TPH-1細胞成泡沫細胞泡沫化和大鼠RAVSMCs的自噬變化。
　　(1)選取SD大鼠最好150-180g，組織培養(yǎng)血管分為空白對照組（只含1％雙抗的無血清的DME

9、M培基）、香芹酚干預組(MCP1終濃度為100ng/ml)。同時留取部分新鮮血管環(huán)于液氮中凍存。WesternBlot檢測其香芹酚對自噬相關蛋白mTOR、p62、LC3Ⅱ和LAMP-2蛋白的表達水平。
　　研究結果:
　　1、 MTT檢測用不同濃度的香芹酚（終末濃度為0.1、1.0、5.0、10 uM）處理巨噬細胞RAW246.7細胞24h后香芹酚的濃度的增加其增殖活性未見明顯變化，與空白對照組相比較，組間比較差異無統(tǒng)計學意

10、義顯著(P＞0.05);用香芹酚(終末濃度為0.1、1.0、5.0、10mM)處理oxldl刺激后24 h，隨著香芹酚的濃度的增加其增殖活性未見明顯變化，組間比較差異無統(tǒng)計學意義顯著(P＞0.05)
　　2、香芹酚在體外實驗中對巨噬細胞系RAW246.7細胞的泡沫化具有明顯的抑制作用Hoechst33258核染色分析顯示經(jīng)不同濃度的香芹酚處理后的RAW246.7細胞24小時后均呈現(xiàn)出明顯的凋亡特征，隨著濃度的增加，細胞數(shù)量逐漸減少

11、，呈現(xiàn)濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀態(tài)的凋亡細胞數(shù)增加，明顯的細胞碎片形成。核染色的結果顯示:阻斷ERKMAPK信號轉導通路后，并沒改變RAW246.7細胞凋亡情況，而阻斷p38MAPK信號轉導通路后RAW246.7細胞凋亡明顯減少。
　　3、香芹酚抑制泡沫細胞脂滴含量:通過顯微鏡觀察，control組胞漿中紅色脂迪數(shù)量很少，胞漿中只有可見數(shù)顆脂滴。ox-LDL處理組細胞胞漿中有大量紅色脂滴，紅色脂滴約占細胞體積的50％以上。與con

12、trol組相比，經(jīng)香芹酚(CAR)孵育后，胞內脂滴含量較ox-ldl處理組組胞內脂滴逐漸減少，并隨著濃度的增加胞內脂滴數(shù)目減少。
　　4、香芹酚抑制ox-LDL誘導的LOX-1表達;與control組相比，不同濃度Carvacrol組LOX-Ⅰ蛋白水平明顯降低，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。且濃度越高，Lox-Ⅰ蛋白水平越低。Carvacrol組LOX-Ⅰ蛋白水平與ox-LDL組相比差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。但Ca

13、rvacrol1uM組與ox-LDL組相比，無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　5、香芹酚抑制ox-LDL誘導泡沫細胞炎癥因子表達:Ox-LDL刺激細胞后，細胞上清液中的TNF-a、IL6、IL-1 beta，與對照組相比有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05vs control)。而Carvacrol處理后隨著濃度的增加，炎癥因子TNF-a、IL6、IL-1 beta相對下降，均與對照組相比有顯著統(tǒng)計學意義(p＜0.05 vs oxld

14、l組)
　　6、香芹酚抑制泡沫細胞LPS誘導的炎癥細胞因子的表達RAW246.7經(jīng)LPS組處理后TNF-a，IL-1 beta、IL-6水平顯著高于其他組別，CAR處理后能抑制LPS誘導的TNF-a的增加(p＜0.01)如圖LPS組處理后TNF-a，IL-1 beta、IL-6水平顯著高于其他組別，CAR處理后能抑制LPS誘導的TNF-a的增加(p＜0.01）。
　　7、香芹酚影響對經(jīng)ox-LDL誘導的單核-巨噬細胞自噬相關

15、蛋白mTOR、 p62表達與control組相比，ox-ldl處理組組中mTOR蛋白表達水平顯著增加(P＜0.05)水平。與ox-ldl組相比，三個劑量香芹酚干預均可使mTOR蛋白表達進一步下降，其中10uMCAR組顯著低于ox-ldl組的。各組的p62蛋白表達趨勢與mTOR基本一致。與ox-ldl組相比，ox-ldl+中劑量組和ox-ldl+香芹酚高劑量組組的p62蛋白表達分別下降，且均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，ox-ldl組L

16、C3Ⅱ蛋白表達低于control組，但無統(tǒng)計學差異。和ox-ldl組相比，香芹酚可上調LC-3Ⅱ蛋白表達，其中ox-ldl+中劑量組LC3Ⅱ表達上調，ox-ldl+香芹酚高劑量組上調，且均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　研究結論:
　　(1)香芹酚在體外實驗中對巨噬細胞系RAW246.7細胞的泡沫化具有明顯的抑制作用;香芹酚調節(jié)泡沫細胞凋亡可能與p38MAPK信號轉導通路相關;
　　(2)香芹酚抑制泡沫細胞脂滴含

17、量;
　　(3)香芹酚抑制ox-LDL誘導的LOX-1表達;
　　(4)香芹酚抑制ox-LDL誘導泡沫細胞炎癥因子表達;
　　(5)香芹酚抑制ox-LDL對NF-κB的激活;
　　(6)香芹酚抑制泡沫細胞LPS誘導的炎癥細胞因子的表達;
　　(7)香芹酚可降低主動脈平滑肌細胞mTOR、p62和LAMP-2的表達，.香芹酚影響對經(jīng)ox-LDL誘導的單核-巨噬細胞自噬相關蛋白mTOR、p62表達。
　　綜