LPS誘導(dǎo)小鼠肺巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激在自噬中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察脂多糖(Lippolysaccride,LPS)對外源性過氧化氫(H2O2)刺激的小鼠肺巨噬細(xì)胞(Ana-1)的氧化損傷的影響，并通過Ana-1細(xì)胞DNA氧化損傷和自噬角度來研究LPS 誘導(dǎo)對Ana-1細(xì)胞氧化應(yīng)激和自噬的作用機(jī)制及其相關(guān)的分子機(jī)制。方法：1.LPS刺激Ana-1細(xì)胞模型的建立及LPS誘導(dǎo)下Ana-1細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的影響。LPS作用于Ana-1細(xì)胞，彗星實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測Ana-1細(xì)胞DNA損傷的情況，ROS

2、熒光探針-DHE檢測Ana-1細(xì)胞內(nèi)活性氧族物質(zhì)(Reactive Oxygen Species,ROS)的表達(dá)情況，總SOD活性檢測試劑盒(WST法)檢測Ana-1細(xì)胞總超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)的表達(dá)情況。LPS作用于氧化應(yīng)激損傷下的Ana-1細(xì)胞，通過彗星實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測Ana-1細(xì)胞DNA損傷的情況，ROS熒光探針-DHE檢測Ana-1細(xì)胞ROS的表達(dá)情況,總SOD活性檢測試劑盒(WST法

3、)檢測Ana-1細(xì)胞總SOD的表達(dá)情況。比較LPS作用于Ana-1細(xì)胞與LPS作用氧化應(yīng)激狀態(tài)下的Ana-1細(xì)胞的指標(biāo)變化情況。2.LPS作用下的Ana-1細(xì)胞自噬現(xiàn)象和LPS作用于氧化應(yīng)激損傷下的Ana-1細(xì)胞自噬現(xiàn)象。LPS濃度為1ug/ml刺激Ana-1細(xì)胞4小時后(LPS處理組),逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ的mRNA表達(dá)水平變化,脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-LC3(

4、green fluorescentprotein-microtubule associated protein light chain3,綠色熒光蛋白-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3)和質(zhì)粒RFP-LC3(Red fluorescent protein-microtubule associated protein light chain3,紅色熒光蛋白-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3)觀察LPS作用下的Ana-1細(xì)胞的自噬現(xiàn)象,免疫蛋白印記( Wester

5、n Blot)法檢測自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表達(dá)。LPS作用氧化應(yīng)激狀態(tài)下的Ana-1細(xì)胞(LPS+H2O2處理組,外源性H2O2濃度為12.5uM刺激Ana-1細(xì)胞2h后,再加入LPS濃度為1ug/ml刺激Ana-1細(xì)胞4h),RT-PCR法檢測自噬相關(guān)因子LC3的mRNA表達(dá)水平變化,脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-LC3和質(zhì)粒RFP-LC3觀察自噬現(xiàn)象, Western Blot法檢測自噬

6、基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達(dá)。維生素C抗氧化應(yīng)激損傷處理后(維生素C濃度為2000ug/ml,刺激1小時后加入H2O2,濃度為12.5uM刺激Ana-1細(xì)胞2h后,再加入LPS濃度為1ug/ml刺激Ana-1細(xì)胞4h)觀察LPS介導(dǎo)下Ana-1細(xì)胞的自噬現(xiàn)象以及Western Blot法檢測自噬基因BECN1蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達(dá)。對照組用PBS刺激進(jìn)行對比。比較對照組、LPS處理組和LPS+H2O2處理組以及維生素C處

7、理組兩兩間所測指標(biāo)的變化和差異。結(jié)果：1.LPS作用于Ana-1細(xì)胞,與對照組相比較,細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)濃度增高,P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義;總SOD的表達(dá)減少,P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)意義;彗星實(shí)驗(yàn)檢測出Ana-1細(xì)胞DNA有損傷,P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)意義提示LPS處理可誘導(dǎo)Ana-1細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。LPS處理后氧化應(yīng)激狀態(tài)下的Ana-1細(xì)胞內(nèi)的ROS的表達(dá)濃度較LPS處理組明顯增高,P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義;總SOD的表達(dá)減少

8、,P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)意義;彗星實(shí)驗(yàn)檢測出Ana-1細(xì)胞DNA有損傷,P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)意義,細(xì)胞損傷明顯。2.共聚焦顯微鏡下觀察對照組、LPS處理組、LPS+H2O2處理組的ROS熒光強(qiáng)度和熒光數(shù)量發(fā)現(xiàn):LPS處理組的ROS熒光強(qiáng)度和熒光數(shù)量與對照組相比較有所增加,P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)意義;LPS+H2O2處理組的ROS熒光強(qiáng)度和熒光數(shù)量較LPS處理組明顯增加,P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.RT-PCR法檢測自噬相關(guān)因子LC

9、3-Ⅱ的mRNA表達(dá)水平變化示LPS+ H2O2處理組較LPS處理組的LC3-Ⅱ的mRNA表達(dá)水平量多;LPS處理組較對照組的LC3-Ⅱ的mRNA表達(dá)水平量多。4.共聚焦顯微鏡下觀察對照組、LPS處理組、LPS+H2O2處理組和維生素C處理組的細(xì)胞自噬GFP-LC3和RFP-LC3轉(zhuǎn)染情況發(fā)現(xiàn)LPS處理組較對照組的自噬小體有所增加;LPS+ H2O2處理組較LPS處理組的自噬小體在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)明顯增加;維生素C處理組較LPS+ H2O2處

10、理組的自噬小體有所減少。5.Western Blot法檢測自噬基因BECN1蛋白表達(dá)示LPS+ H2O2處理組較LPS處理組的BECN1表達(dá)水平量增多,P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)意義;LPS處理組較對照組的BECN1表達(dá)水平量增多,P<0.01具有統(tǒng)計學(xué)意義。Western Blot法檢測自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達(dá)示維生素C處理組較LPS+H2O2處理組的LC3表達(dá)水平量減少,P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義;LPS+H2O2處理組較LPS處理

11、組的LC3表達(dá)水平量增多,P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義;LPS處理組較對照組的LC3表達(dá)水平量增多,P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：1.外源性H2O2可誘導(dǎo)小鼠肺巨噬細(xì)胞Ana-1的氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細(xì)胞損傷。LPS能加重H2O2誘導(dǎo)小鼠肺巨噬細(xì)胞Ana-1的氧化應(yīng)激,加重細(xì)胞的DNA損傷。2.LPS能加重氧化應(yīng)激下小鼠肺巨噬細(xì)胞Ana-1的自噬。氧化應(yīng)激下小鼠肺巨噬細(xì)胞Ana-1的自噬與氧化應(yīng)激細(xì)胞DNA損傷有關(guān),LPS能加重這一現(xiàn)象可能