mTOR和細(xì)胞自噬在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中分子調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mechanistic target of rapamycin，mTOR)參與了包括細(xì)胞代謝、增殖和自噬等在內(nèi)的大部分生理過程;同時(shí)，也調(diào)控了許多代謝和增殖相關(guān)的疾病，如糖尿病、肥胖、神經(jīng)退行性疾病以及腫瘤等。目前mTOR-細(xì)胞自噬通路在人體疾病中的研究方興未艾，但是該信號通路在呼吸系統(tǒng)疾病，特別是對于上皮細(xì)胞在急性肺損傷(acute lung injury，ALI)中的作用關(guān)注甚少，其調(diào)控機(jī)制也尚未明確。

2、>　　目的:建立脂多糖(LPS)干預(yù)肺上皮細(xì)胞的體外感染模型和誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的動(dòng)物感染模型，探索mTOR和細(xì)胞自噬在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制。
　　方法:建立體外LPS干預(yù)人HBE細(xì)胞的感染模型，采用Q-PCR和ELISA法檢測HBE細(xì)胞及其上清中炎癥因子的變化;采用Western Blot法檢測HBE細(xì)胞中mTOR-自噬相關(guān)信號通路中重要蛋白以及NF-κB信號通路中p65，p-p65的表達(dá)。此外，將已鑒

3、定的8周齡左右的mTOR肺泡或氣道上皮條件性敲除小鼠隨機(jī)分為4組，即對照組、對照模型組，實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M。對照組和實(shí)驗(yàn)組氣道滴注PBS(50μl)，其相應(yīng)模型組氣道滴注LPS(2mg/50μl)。觀察并測定各組小鼠肺灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、肺組織病理學(xué)、肺水腫、肺血管通透性的改變;采用ELISA法檢測BALF中炎癥因子的表達(dá)，采用Q-PCR法測定肺組織中的炎癥因子的表達(dá);采用Western Blot法測定mTOR-自噬信號

4、通路中重要蛋白的變化。觀察mTOR肺泡和氣道上皮條件性敲除小鼠對生存率的影響。
　　結(jié)果:目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LPS干預(yù)的HBE細(xì)胞和誘導(dǎo)的急性肺損傷模型都能明顯上調(diào)mTOR的磷酸化水平，并且抑制自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ的表達(dá)。同時(shí)，活化的mTOR能激活TLR4信號通路。利用mTOR敲除或自噬相關(guān)蛋白(LC3B，ATG5和BECN1)過表達(dá)的HBE細(xì)胞能明顯降低LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥因子IL-6和IL-8的表達(dá)。相反，LPS刺激自噬相

5、關(guān)基因（LC3B，ATG5和BECN1）敲除的細(xì)胞或自噬抑制劑（Baf-A1和CQ）干預(yù)的細(xì)胞可通過活化NF-κB信號通路上調(diào)IL-6和IL-8的表達(dá)。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以氣道滴注LPS建立小鼠ALI模型。LPS氣道滴注小鼠24小時(shí)后，與對照模型組比較，mTOR肺泡和氣道上皮條件性敲除的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M能明顯減輕肺組織的病理損傷的程度，顯著改善肺水腫和肺血管滲透性的變化，降低肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)與白細(xì)胞計(jì)數(shù)，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)（如IL-6、KC、M