Caveolin-1在LPS誘導(dǎo)AT-1細(xì)胞和小鼠肺部急性損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distresssyndrome,ARDS)為臨床常見(jiàn)的危重癥,主要表現(xiàn)為急性呼吸窘迫、頑固性低氧血癥和非心源性肺水腫。ALI/ARDS可發(fā)生于任何年齡段的患者,通常由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等因素誘發(fā)。但迄今為止其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。近年來(lái),病理研究結(jié)果顯示,ALI/ARDS發(fā)生時(shí)受損傷最明顯的結(jié)構(gòu)是肺泡上皮,尤其是肺泡Ⅰ型

2、上皮細(xì)胞(AT-1)對(duì)損傷更敏感,而且這種損傷常常發(fā)生在ALI/ARDS的早期階段。
　　 小窩蛋白(Caveolin,Cln)是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為21-24kD的膜蛋白,高度富集于蛋白小窩膜(Caveolea,Cle),是Cle的標(biāo)志性蛋白,具有多種潛在功能,在維持Cle形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能中起重要作用。目前發(fā)現(xiàn),哺乳動(dòng)物中至少存在3種Cln基因家族產(chǎn)物,即Cln-1,Cln-2及Cln-3。其中Cln-1廣泛存在于肺泡Ⅰ型上皮細(xì)

3、胞膜,并有證據(jù)表明Cln-1/Cle在肺泡上皮屏障功能變化中扮演重要角色。
　　 本研究應(yīng)用pRNAi-u2.6-Cln-1慢病毒載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞(AT-1)和c57BL6小鼠,并觀察Caveolin-1基因?qū)PS致炎AT-1細(xì)胞和小鼠的影響及作用機(jī)制,為臨床防治ALI/ARDS提供新的思路。
　　 研究?jī)?nèi)容和方法:
　　 1.小鼠Cln-1基因的克隆及載體構(gòu)建:PCR法擴(kuò)增Cl-1 cDNA全

4、長(zhǎng)基因序列,將其克隆至慢病毒表達(dá)載體pRNAi-u2.6上并進(jìn)行慢病毒包裝。
　　 2.肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞分離、培養(yǎng):PE標(biāo)記的AT-1細(xì)胞特異性抗體RTI40標(biāo)記細(xì)胞,采用抗PE的免疫磁珠陽(yáng)性篩選AT-1細(xì)胞,流式細(xì)胞儀測(cè)定純度。
　　 3.慢病毒載體pRNAi-u2.6-Cln-1轉(zhuǎn)染AT-1及鑒定:慢病毒載體pRNAi-u2.6-Cln-1病毒上清轉(zhuǎn)染AT-1細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光,流式細(xì)胞儀測(cè)定

5、轉(zhuǎn)染效率,用Western-blotting法鑒定轉(zhuǎn)染AT-1細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)情況。
　　 4.Cln-1基因?qū)PS致炎AT-1細(xì)胞的影響及作用機(jī)制:
　　 (1)LPS致炎AT-1細(xì)胞模型:AT-1細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染目的基因的實(shí)驗(yàn)組及轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組,均給予LPS刺激,濃度10μg/ml,分2hr和4hr兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)。
　　 (2)ELISA法測(cè)定LPS致炎細(xì)胞上清液的炎性因子TNF-α、IL-6表達(dá)水平。

6、>　　 (3)熒光定量PCR法檢測(cè)LPS致炎AT-1細(xì)胞cPLA2和p38 MAPK mRNA表達(dá)變化。
　　 (4)Western blotting法檢測(cè)LPS致炎AT-1細(xì)胞cPLA2、p38 MAPK蛋白表達(dá)變化。
　　 (5)EMSA法檢測(cè)LPS致炎AT-1細(xì)胞核蛋白NF-κB表達(dá)變化。
　　 (6)特異性阻斷cPLA2、p38 MAPK、NF-κB后,細(xì)胞上清液TNF-α、IL-6表達(dá)水平變化及相互作

7、用。
　　 5.觀察Cln-1基因?qū)PS致炎小鼠的影響及作用機(jī)制:
　　 (1)慢病毒載體pRNAi-u2.6-Cln-1轉(zhuǎn)染c57BL6小鼠及LPS致炎小鼠模型:c57BL6小鼠分為轉(zhuǎn)染目的基因的實(shí)驗(yàn)組及轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組,經(jīng)尾靜脈注入caveolin-1慢病毒載體,1月后給予腹腔注射LPS,2mg/kg,分2hr和4hr兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)。
　　 (2)ELISA法測(cè)定LPS致炎小鼠血清的TNF-α、IL-6表達(dá)水

8、平。
　　 (3)Western blotting法檢測(cè)LPS致炎小鼠肺組織cPLA2、p38 MAPK蛋白表達(dá)變化。
　　 (4)病理形態(tài)學(xué)觀察LPS致炎小鼠肺組織HE染色切片。
　　 結(jié)果:
　　 1.PCR法成功擴(kuò)增出Cln-1 cDNA全長(zhǎng)序列,并將其克隆至慢病毒表達(dá)載體pRNAi-u2.6,病毒包裝后得pRNAi-u2.6-Cln-1慢病毒。
　　 2.獲得原代培養(yǎng)的肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞,純

9、度可達(dá)85％～98％,細(xì)胞總量為3-5×106。
　　 3.慢病毒載體轉(zhuǎn)染肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞后,在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光,細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率＞95％。Western blotting法可檢測(cè)到相應(yīng)目的蛋白的表達(dá),24hr后Cln-1表達(dá)開(kāi)始升高,36hr的表達(dá)量比轉(zhuǎn)染前表達(dá)量顯著升高,72hr達(dá)到峰值。
　　 4.LPS干預(yù)AT-1細(xì)胞后,在2hr及4hr時(shí)相點(diǎn),高表達(dá)Cln-1實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液TNF-α、IL-6的表

10、達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組,P＜0.05。實(shí)驗(yàn)組AT-1細(xì)胞cPLA2和p38MAPK mRNA的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組,P＜0.05;Western blotting結(jié)果顯示,cPLA2和p38 MAPK總蛋白及磷酸化蛋白水平也同步升高,P＜0.05。EMSA法測(cè)定核蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組NF-κB的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組,P＜0.05。阻斷cPLA2/p38 MAPK及下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB均可引起炎癥因子(TNF-α、IL-6)顯著下

11、降,p＜0.05。cPLA2抑制劑可以下調(diào)磷酸化的p38 MAPK及NF-κB的表達(dá),p＜0.05;p38 MAPK抑制劑能夠降低磷酸化的cPLA2及NF-κB的表達(dá),p＜0.05,而NF－κB的抑制劑對(duì)磷酸化的cPLA2和p38 MAPK表達(dá)無(wú)明顯影響,p＞0.05。
　　 5.LPS干預(yù)c57BL6小鼠后,在2hr及4hr時(shí)相點(diǎn),高表達(dá)Cln-1實(shí)驗(yàn)組小鼠血清TNF-α、IL-6的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組,P＜0.05。實(shí)驗(yàn)組小

12、鼠肺組織cPLA2和p38MAPK蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組,P＜0.05。小鼠肺組織病理切片顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠肺部滲出、水腫更明顯,損傷更嚴(yán)重。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建Cln-1基因高表達(dá)的肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞模型。
　　 2.Caveolin-1加重LPS引起的肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞和小鼠肺部損傷。
　　 3.Caveolin-1上調(diào)cPLA2及其信號(hào)通路下游分子p38 MAPK、NF-κB,是LPS引