慶大霉素致大鼠急性腎損傷Caveolin-1表達(dá)及其作用的初步探討.pdf

1、目的：急性腎功能衰竭(acuterenalfailure，ARF)是腎小球濾過率(GFR)急劇降低、血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)增高的惡性癥候群，最為常見的病因為缺血和中毒所致急性腎小管壞死(acutetubularnecrosis，ATN)。如何增強腎小管抗損傷能力，提高腎小管上皮細(xì)胞再生與修復(fù)，對預(yù)防和治療ARF有重要的意義。氨基糖甙類為臨床常用抗生素之一，但是易引起腎臟毒性，并以損傷腎皮質(zhì)的近曲小管上皮細(xì)胞而導(dǎo)致ATN為

2、特征。值得注意得是，ATN之后受損腎小管存在自然修復(fù)過程，如果闡明自身修復(fù)機制，將為臨床ARF患者的救治提供理論依據(jù)。但是，迄今為止對其損傷及修復(fù)機制卻知之甚少。 近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞膜表面具有富集大量信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)微區(qū)域，以特異性瓶頸樣內(nèi)陷為特征，稱為細(xì)胞膜小凹(caveolae)，是細(xì)胞信號級聯(lián)反應(yīng)的樞紐。細(xì)胞膜小凹的主要標(biāo)記蛋白為小凹蛋白家族，其中小凹蛋白-1(caveolin-1)可通過自身的腳手架區(qū)域與細(xì)

3、胞膜小凹內(nèi)多種信號分子相結(jié)合，從而參與多種病理生理過程。眾所周知，ATN發(fā)生時，小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞能夠分泌多種生長因子，這些因子與腎組織內(nèi)相應(yīng)受體相結(jié)合，在ATN后的小管修復(fù)過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，在缺血、慶大霉素或順鉑所致ATN后修復(fù)期，腎組織表皮生長因子(EGF)及其mRNA的表達(dá)均有所增加，而其特異性受體——表皮生長因子受體(EGFR)位于細(xì)胞膜小凹內(nèi)，是小凹蛋白-1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。 小凹蛋白-1高表達(dá)

4、于多數(shù)終末分化細(xì)胞，然而腎小管上皮細(xì)胞雖高度分化，但迄今為止的研究顯示，在正常腎小管上皮細(xì)胞并不能檢測到小凹蛋白-1的表達(dá)。國外有學(xué)者報道，在缺血再灌注導(dǎo)致的急性腎功能衰竭大鼠中，細(xì)胞膜表面的細(xì)胞膜小凹的結(jié)構(gòu)被破壞，且在急性損傷期小凹蛋白-1的表達(dá)略有增加，至于小凹蛋白在修復(fù)期中表達(dá)變化、分布及作用尚未見報道。有鑒于此，本實驗采用慶大霉素誘導(dǎo)大鼠ATN模型，探討ATN后修復(fù)期小凹蛋白-1在腎皮質(zhì)內(nèi)的表達(dá)情況，以及其與EGFR之間關(guān)系，以

5、期為ATN后修復(fù)機制的研究提供新技術(shù)、新思路，以利尋找臨床合理用藥、防治ATN方案。 方法：本實驗選取健康雄性Wistar大鼠，隨機分為2組：正常對照組(n=6)和模型組(慶大霉素，每天400mg/kg，分3次皮下注射連續(xù)2天，n=24)，分別于最后一次給藥后的第4、6、8、10天取材、取血。左側(cè)1/2腎臟固定于4﹪多聚甲醛中，作石蠟切片進(jìn)行過碘酸-雪夫氏(PAS)染色觀察腎皮質(zhì)形態(tài)學(xué)改變，及免疫組織化學(xué)染色觀察損傷后腎皮質(zhì)內(nèi)小

6、凹蛋白-1表達(dá)；另1/2腎臟直接冰凍，作冰凍切片，用免疫熒光雙抗體染色法觀察小凹蛋白-1與增殖抗原(Ki67)及EGFR的表達(dá)；右側(cè)分離腎皮質(zhì)和髓質(zhì)，用Westernblot的方法檢測小凹蛋白-1表達(dá)。 結(jié)果：1.慶大霉素誘導(dǎo)大鼠ATN模型建立：慶大霉素給藥后的第4天(day4)，SCr相對于正常對照組(normalcontrol)明顯升高(P＜0.001)，第6天(ddy6)達(dá)到最高峰，而后逐漸降低。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，day4腎

7、皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)空泡形成，腎小管上皮脫落壞死、剝離，腎小管管腔可見細(xì)胞壞死碎片，基底膜裸露、斷裂等改變；day6以上表現(xiàn)雖更為明顯，但與此同時新生的近曲小管上皮細(xì)胞亦隨之出現(xiàn)；day10裸露的基底膜被新再生的小管上皮細(xì)胞覆蓋，部分細(xì)胞成立方狀，并伴刷狀緣形成，從而表明慶大霉素誘導(dǎo)的大鼠ATN模型建立成功。 2.ATN后腎臟皮質(zhì)中小凹蛋白-1的表達(dá)：Westernblot檢測觀察到慶大霉素誘導(dǎo)大鼠ATN后修復(fù)期腎皮質(zhì)內(nèi)小凹蛋

8、白-1表達(dá)上調(diào)；對各條帶進(jìn)行相對光密度分析，其結(jié)果表明：day4平均相對光密度與正常對照組相比增加6倍(P＜0.01)，day6達(dá)到高峰，而后表達(dá)逐漸降低。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示在正常腎臟皮質(zhì)組織中近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)無小凹蛋白-1的表達(dá)；慶大霉素誘導(dǎo)大鼠ATN后的day4，小凹蛋白-1開始表達(dá)于新生近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)，day6至day8表達(dá)增加，此后表達(dá)逐漸減弱。 3.ATN后腎小管修復(fù)再生過程：采用Ki67檢測慶大霉素誘導(dǎo)的

9、ATN后腎小管上皮細(xì)胞增殖的動態(tài)變化過程。結(jié)果表明：在給予慶大霉素后的day4可以觀察到較多Ki67核陽性的近曲小管上皮細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)結(jié)果與正常對照組相比顯示平均每mm2內(nèi)近曲小管陽性上皮細(xì)胞數(shù)增加2.9倍；day6為再生最旺盛期，然后逐漸降低。 4.小凹蛋白-1與Ki67之間的關(guān)系：免疫熒光雙抗體染色法觀察給藥后day6，可見Ki67和小凹蛋白-1共同表達(dá)于再生的腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞中。 5.小凹蛋白-1與表皮生長因