綠茶多酚對大鼠腦缺血組織微血管段caveolin-1表達的影響.pdf

1、前言
　　 腦缺血是嚴重威脅人類健康的高發(fā)的疾病之一,其損傷機制有興奮性毒性,鈣超載,細胞凋亡,炎癥,自由基,一氧化氮以及線粒體的損傷。血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞和功能的變化是腦缺血早期的重要病理過程之一,并且是腦缺血早期死亡的主要危險因素之一。因此,研究腦缺血時血腦屏障通透性的變化以及可能的保護機制對腦缺血的治療具有重要的意義。
　　 綠茶多酚(green tea polyphenols,GTPs)是綠茶中所含的一類多羥基酚類化

2、合物的總稱,其主要成分是兒茶素類化合物,其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)的含量最高,約占兒茶素的80％,被認為是綠茶多酚生物活性的主要來源。近年來研究發(fā)現(xiàn),綠茶多酚具有多方面的藥理作用,如抗氧化、抗焦慮、抗腫瘤、抗輻射損傷、抗炎、降低血糖和血脂作用等,其神經(jīng)保護作用機制與金屬螯合,自由基清除,影響細胞存活和凋亡基因的過度表達以及對信號轉(zhuǎn)導通路,線粒體功能和泛素.蛋白酶體系統(tǒng)的

3、調(diào)節(jié)有關(guān),通過這些機制,綠茶多酚對帕金森病和阿爾茨海默氏癥等神經(jīng)變性疾病具有防治作用。但綠茶多酚對腦缺血時血腦屏障通透性的影響尚未見報道。
　　 腦微血管內(nèi)皮細胞是血腦屏障的重要組成部分,內(nèi)皮細胞質(zhì)膜表面含有豐富的內(nèi)陷囊狀結(jié)構(gòu),即胞膜窖(caveolae)。物質(zhì)通過血腦屏障一般有兩種途徑:細胞旁途徑和跨細胞途徑。Caveolae介導的內(nèi)化途徑是經(jīng)典的跨細胞途徑之一,caveolin-1是caveolae的標志性蛋白,內(nèi)皮細胞有可

4、能是通過ERK1/2和p38MAPK途徑下調(diào)caveolin-1的表達。本研究通過給大鼠灌胃服用綠茶多酚,旨在探討綠茶多酚對腦缺血大鼠血腦屏障通透性的影響和可能的相關(guān)機制。
　　 材料和方法
　　 一、實驗材料
　　 (一)實驗動物
　　 本研究采用中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供的Wistar大鼠,雄性,體重250～300g。
　　 (二)主要試劑
　　 綠茶多酚(杭州禾田生物有限公司)；兔

5、抗大鼠caveolin-1,p-ERK1/2和ERK1/2抗體(美國Santa Cruz公司)；小鼠抗大鼠β-actin抗體(武漢博士德試劑公司)；β-actin,辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二次抗體(北京中山公司)；辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗(武漢博士德試劑公司)；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑(福州邁新生物技術(shù)有限公司)；RT-PCR試劑盒(Takara公司)；伊文思藍(日本Fluka公司)。
　　 (三)主要儀器

6、r>　　 大鼠腦立體定位儀(日本光電株式會社)；激光多普勒腦血流儀(moorLAB,England)；PCR儀(德國Biometra公司)；電子分析天平；恒溫水浴箱；低溫冷凍離心機(Hitachi,Japan)；通用電泳儀(Bio-Rad,USA)；轉(zhuǎn)印儀(北京市六一儀器廠)；-80℃深度冰箱(Toshiba,Japan)；恒溫冷凍切片機(Leica,GER)。
　　 二、實驗方法
　　 (一)動物準備及分組:

7、　　 實驗大鼠隨機分成兩組:對照組和綠茶多酚組,根據(jù)缺血時間不同,將每組大鼠進一步分為:缺血0h組,缺血1h組,缺血2h組及缺血4h組。綠茶多酚組大鼠按400mg/kg灌服綠茶多酚蒸餾水溶液,每日2次,每次1mL,；對照組給予等體積蒸餾水,自由飲食,活動。灌胃30天后,進行局灶性腦缺血模型的制作。
　　 (二)大鼠腦缺血模型的制備。
　　 (三)大鼠神經(jīng)行為學評分和腦梗死體積的測定。
　　 (四)應用伊文思藍滲

8、透性評估血腦屏障通透性的變化。
　　 (五)RT-PCR法檢測缺血腦組織微血管段caveolin-1的mRNA表達。
　　 (六)免疫組化法檢測缺血腦組織微血管內(nèi)皮細胞caveolin-1的分布和表達變化。
　　 (七)Wesrern blot法檢測缺血腦組織微血管段caveolin-1,p-ERK1/2蛋白表達的變化。
　　 (八)圖象分析
　　 免疫組化結(jié)果用Motic Images Adtv

9、anced 3.2實時圖象分析系統(tǒng)采集照片并進行定量分析。Western blot結(jié)果用Chemi Imager 5500V 2.03軟件掃描,用Fluor Chen2.0軟件定量分析顯色帶的IDV值。
　　 (九)統(tǒng)計學處理
　　 所有數(shù)值均以均數(shù)±標準差表示,實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 討論
　　 在本研究中,預先對大鼠進行灌胃服用

10、綠茶多酚溶液,然后建立局灶性腦缺血模型,觀察綠茶多酚對大鼠腦缺血后血腦屏障通透性變化的影響。發(fā)現(xiàn)與對照組缺血0h相比,缺血1h,2h和4h組缺血區(qū)腦組織EB含量顯著增加:綠茶多酚的缺血1h,2h,4h組的EB含量與對照組缺血同時點組相比顯著下降,綠茶多酚顯著下調(diào)缺血腦組織微血管段的caveolin-1 mRNA,蛋白水平和p-ERK1/2蛋白表達。本研究結(jié)果提示,綠茶多酚對腦缺血時血腦屏障的通透性具有保護作用,其機制可能與血管內(nèi)皮細胞的

11、caveolin-1 mRNA和蛋白的表達下調(diào)相關(guān),p-ERK1/2表達下調(diào)可能與caveolin-1的變化相關(guān)。
　　 腦缺血導致血腦屏障開放,已有研究證明綠茶多酚能預防中風,可以作為腦缺血后的神經(jīng)保護因子。目前關(guān)于綠茶多酚的研究主要是對神經(jīng)元的保護作用。綠茶多酚口服吸收后分布廣泛,也可通過血腦屏障進入腦組織,減少腦缺血導致的梗死體積和神經(jīng)元損傷。在動物實驗中,EGCG具有顯著的抗氧化功能,可以預防局部腦缺血造成的神經(jīng)損傷和梗

12、塞,腦缺血再灌注后腦梗死體積明顯降低,依然能顯示抗氧化和預防神經(jīng)損傷的功能。在本研究中與對照組相比,綠茶多酚組顯著降低了缺血組增高的血腦屏障通透性,首次證實綠茶多酚對缺血時血腦屏障的通透性具有保護作用。
　　 Caveolin是caveolae的主要結(jié)構(gòu)成分,在內(nèi)皮細胞的功能有:跨細胞轉(zhuǎn)運作用,入胞作用,調(diào)節(jié)內(nèi)皮組織通透性,致動脈粥樣硬化,并參與G-蛋白介導的信號轉(zhuǎn)導,酪氨酸激酶的級聯(lián)反應,蛋白激酶C和eNOS的信號通路等,在血

13、腦屏障中具有重要作用,但其作用機制還不清楚。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulated protein kinases,ERK)包括ERK-1和ERK2,統(tǒng)稱為ERK1/2,磷酸化激活后,可將信號從表面受體傳至核內(nèi),作用于多種轉(zhuǎn)錄因子,在神經(jīng)系統(tǒng)中ERK1/2調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化,可塑性及神經(jīng)元存活,介導了胞外因子的神經(jīng)保護作用。
　　 在本研究中,腦缺血后微血管內(nèi)皮細胞ERK1/2磷酸化水平表達增加,而綠茶多酚

14、則使ERK1/2活性顯著降低。我們推測綠茶多酚有可能通過調(diào)節(jié)NOS活性,進而改變內(nèi)皮細胞caveolin-1的表達水平,ERK1/2可能是其發(fā)揮作用的重要物質(zhì)之一。
　　 結(jié)論
　　 1、綠茶多酚組顯著降低了腦缺血時增高的血腦屏障通透性。
　　 2、綠茶多酚顯著降低了腦缺血時增加的腦微血管內(nèi)皮細胞caveolin-1的mRNA和蛋白表達,這可能是綠茶多酚對缺血時血腦屏障通透性起到保護作用的機制之一。