Caveolin-1在大鼠急性胰腺炎肺損傷機(jī)制中的作用及清胰湯治療機(jī)制的研究.pdf

1、重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)早期易合并急性肺損傷(acute lung injury,ALI),是導(dǎo)致患者死亡主要原因。SAP誘發(fā)ALI的機(jī)制復(fù)雜,目前認(rèn)為,與SAP激活全身炎癥反應(yīng)系統(tǒng),釋放大量細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和活性氧等進(jìn)而影響肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性和水的跨肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。
　　 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)是SAP誘發(fā)ALI過

2、程中的重要炎癥介質(zhì),血清和肺組織中TNFα水平的高低與肺損傷程度密切相關(guān)。TNFα的大部分生物學(xué)功能是通過其受體TNFR-1(TNF receptor-1)介導(dǎo)的,TNFR-1定位在胞膜窖(caveolae)。
　　 Caveolae是50-100 nm的燒瓶樣質(zhì)膜內(nèi)陷,屬于脂筏的一種,存在于絕大多數(shù)組織細(xì)胞的質(zhì)膜上。Caveolin-1(Cav-1)是caveolae結(jié)構(gòu)和功能的標(biāo)志蛋白,在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)吞等過程

3、中發(fā)揮著重要作用。TNFα是調(diào)節(jié)Cav-1表達(dá)的主要介質(zhì),其受體TNFR-1具有caveolin結(jié)合模序,定位在caveolae。因此,TNFα可以通過其受體影響caveolae/cav-1的表達(dá)和功能,并進(jìn)一步調(diào)控多種信號(hào)通路的活性而產(chǎn)生不同的效應(yīng)。已有研究表明,肺泡巨噬細(xì)胞釋放的TNFα可通過TNFR-1下調(diào)Cav-1的表達(dá),從而活化多種炎癥反應(yīng)信號(hào)通路而導(dǎo)致肺組織損傷。然而,到目前為止,Cav-1和TNFR-1在SAP誘發(fā)ALI過

4、程中的表達(dá)變化及意義尚未得到闡明。
　　 肺內(nèi)水和電解質(zhì)的跨肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)也受caveolae調(diào)節(jié)。Caveolae膜微區(qū)對水相對可滲透可能與caveolae上存在高水平的水通道蛋白(aquaporins,AQPs)有關(guān)。AQPs是一組能促進(jìn)細(xì)胞膜水通透性增加的跨膜蛋白,有些AQPs可以與質(zhì)膜上的脂筏相互作用而影響其對水的通透性。已有研究表明,肺組織中表達(dá)的AQP1和AQP5與肺損傷時(shí)肺組織中過多液體的清除有關(guān)。但有關(guān)二者在脂

5、筏上的定位及與Cav-1表達(dá)的相關(guān)性報(bào)道卻甚少。
　　 目前,臨床對SAP誘發(fā)ALI的治療多采用綜合性方案,其中,中藥清胰湯已取得了肯定的臨床效果。雖然對清胰湯的作用機(jī)制已經(jīng)開展了多方面的研究,但其是否對肺組織Cav-1的表達(dá)產(chǎn)生影響目前尚無報(bào)道。
　　 本研究采用胰膽管逆行注射脫氧膽酸鈉誘發(fā)胰腺炎肺損傷大鼠模型。Wistar大鼠隨機(jī)分四組:假手術(shù)(sham operation,SHAM)組,胰腺炎肺損傷(ALI)組、地

6、塞米松(dexamcthasone,DEX)組和清胰湯(Qingyitang,QYT)組。DEX組于造模后即舌下靜脈注射地塞米松2mg/kg;QYT組于造模動(dòng)物清醒后即給予清胰湯灌胃10ml/kg,12 h后再灌胃一次。24 h后采血和肺組織,檢測血清淀粉酶、肺濕/干重比值和肺組織病理切片判定模型的損傷程度;放免法檢測血清TNFa水平;RT-PCR和免疫組化分別檢測肺組織中Cav-1、TNFR-1、AQP1和AQP5的mRNA和蛋白表達(dá)

7、;蔗糖密度梯度離心提取脂筏,Western Blotting檢測Cav-1、TNFR-1、AQP1和AQP5在脂筏內(nèi)外的分布及表達(dá)。
　　 本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.SAP誘發(fā)ALI大鼠模型的建立及DEX和QYT的治療作用
　　 與SHAM組相比,ALI組大鼠血清淀粉酶水平、肺濕/干重比值和血清TNFα水平均顯著升高(P＜0.01)。光鏡下可見肺間質(zhì)充血、水腫,炎性細(xì)胞浸潤;肺泡間隔明顯增厚,肺泡腔部分融

8、合成肺大泡;毛細(xì)血管擴(kuò)張,有局灶性出血。與ALI組相比,經(jīng)DEX或QYT治療的大鼠血清淀粉酶水平、肺濕/干重比值、血清TNFα水平顯著下降(P＜0.01),肺組織炎癥反應(yīng)明顯減輕。
　　 2.SAP誘發(fā)ALI大鼠肺組織中Cav-1與TNFR-1的表達(dá)及清胰湯的可能作用機(jī)制
　　 RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示,同SHAM組相比,ALI組大鼠肺組織中Cav-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P＜0.01),而TNFR-

9、1的表達(dá)卻有所升高(P＜0.01)。DEX和QYT治療組大鼠肺組織中Cav-1的表達(dá)有不同程度的恢復(fù)(P＜0.01),TNFR-1的表達(dá)則顯著低于ALI組(P＜0.01)。
　　 Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn),Cav-1和TNFR-1在脂筏內(nèi)外均有分布,但都以脂筏內(nèi)為主。與SHAM組相比,ALI組大鼠肺組織脂筏內(nèi)外Cav-1的表達(dá)量均下降,而TNFR-1的表達(dá)卻有所升高,尤以脂筏內(nèi)升高明顯,提示可能存在TNFR-1向

10、筏區(qū)的轉(zhuǎn)位。經(jīng)DEX或QYT治療后,大鼠肺組織脂筏內(nèi)外Cav-1的表達(dá)量明顯較ALI組升高,尤其是脂筏內(nèi),而TNFR-1在脂筏內(nèi)外的表達(dá)量均下降。
　　 3.SAP誘發(fā)ALI大鼠肺組織中Cav-1與AQP1和AQP5的表達(dá)及清胰湯的可能作用機(jī)制
　　 RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示,ALI組大鼠肺組織中Cav-1、AQP1和AQP5的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P＜0.01),而經(jīng)DEX或QYT治療后,大鼠肺組織中

11、三者的表達(dá)水平則有不同程度的上升(P＜0.01)。
　　 Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn),Car-1主要分布在脂筏內(nèi),脂筏外有少量分布,AQP1只分布在脂筏內(nèi),有原型和糖基化兩種形式,而AQP5則只在筏外區(qū)可見。與SHAM組相比,ALI組大鼠肺組織脂筏內(nèi)外Cav-1的表達(dá)量均降低,AQP1和AQP5的表達(dá)量也明顯降低。而在DEX和QYT治療組中,脂筏內(nèi)外Cav-1的表達(dá)量及AQP1和AQP5的表達(dá)水平均較ALI組有明顯

12、升高。
　　 結(jié)論:
　　 1.SAP誘發(fā)的ALI大鼠肺組織中表達(dá)的TNFR-1和AQP1與Cav-1均主要表達(dá)在脂筏上,而AQP5則在筏區(qū)外。
　　 2.SAP誘發(fā)的ALI大鼠肺組織中TNFR-1表達(dá)升高,并可能存在向筏區(qū)的轉(zhuǎn)位,而Cav-1的表達(dá)則下降。提示TNFα可能通過TNFR-1抑制了Cav-1的表達(dá),而Cav-1的作用類似于細(xì)胞外信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞的中繼站,可能通過進(jìn)一步影響多條胞內(nèi)炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路活

13、化而參與了肺損傷的發(fā)生。
　　 3.SAP誘發(fā)的ALI大鼠肺組織中Cav-1、AQP1和AQP5的表達(dá)均下降,提示Cav-1的表達(dá)下調(diào)可能通過影響脂筏上AQP1的表達(dá)而削弱了肺損傷時(shí)機(jī)體對肺組織中過多液體的清除能力而使肺水腫加重。AQP5的表達(dá)可能不受Cav-1的影響,其表達(dá)下調(diào)可能是其他機(jī)制所致。
　　 4.清胰湯能有效減輕SAP大鼠ALI的損傷程度,一方面可能是通過下調(diào)TNFR-1的表達(dá),進(jìn)而使Cav-1表達(dá)增加而抑