肺表面活性物質相關蛋白A、分泌性磷脂酶A-,2--Ⅱ在急性胰腺炎肺損傷中的作用及清胰湯干預機制的實驗研究.pdf

1、目的： 探討重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)肺損傷(acutelung iniury，ALI)時肺表面活性蛋白A(surfactant protein A，SP-A)、分泌型磷脂酶A2-Ⅱ(secreted phospholipase A2，sPLA2-Ⅱ)的表達，及其在ALI發(fā)病中的作用，同時觀察肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar type Ⅱ cells，AT Ⅱ)在急性胰腺炎肺損

2、傷時的形態(tài)及功能改變，并觀察清胰湯對SP-A、sPLA2-Ⅱ表達及病情轉歸的影響。急性重癥胰腺炎時增高的sPLA2-Ⅱ對AT Ⅱ細胞損傷作用是引起急性胰腺炎肺損傷的重要因素，急性胰腺炎相關性腹水中sPLA2含量明顯增高。本研究進一步行ATⅡ細胞原代培養(yǎng)，用大鼠SAP模型腹水干預細胞，觀察細胞增殖狀況和生存率改變；并分別應用sPLA2-Ⅱ抑制劑(KH064)、Emodin干預，觀察其對腹水預處理AT Ⅱ細胞增殖、SP-A表達的影響，及對細

3、胞形態(tài)功能的影響。進一步揭示SP-A、sPLA2 Ⅱ及AT Ⅱ細胞在急性胰腺炎肺損傷發(fā)病中的作用，為臨床治療急性肺損傷尋求更為合適的藥物作用靶點。 方法： 實驗一：采用膽胰管內逆行注入1.5％去氧膽酸鈉建立大鼠SAP時ALI模型。將SD大鼠隨機分為假手術組(SO組，n=10)、模型組(SAP組，n=10)、清胰湯組(QYT組，n=10)、地塞米松組(DEX組，n=10)、善寧組(SS組，n=101和分泌型磷脂酶A2-Ⅱ抑

4、制劑組(KH064，n=10)。SO組僅行剖腹術，翻動胰腺。QYT組在建立SAP模型后30 min、12h清胰湯灌胃(10 mL/kg)。DEX組于造模后30min、12h靜脈注射地塞米松(10mg/kg)。SS組在造模后30min、12h皮下注射善寧(50 μg/kg)。KH064組于造模后30min、12h給予KH064灌胃(5mg/kg)。各組動物在術后24 h測PaO2、PaCO2、pH和血淀粉酶、sPLA2、肺濕/干比。應用逆

5、轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測肺組織SP-A、sPLA2-Ⅱ mRNA的表達強度，采用Western-bolt檢測肺組織SP-A、sPLA2-Ⅱ表達，免疫組化觀察肺組織SP-A表達，并觀察胰、肺病理變化及ATⅡ細胞的電鏡下變化。 實驗二：采用Dobbs方法提取AT Ⅱ細胞，首先肺動脈灌洗減少肺內紅細胞，肺離體后經氣管灌洗除去肺泡腔內的白細胞，將胰蛋白酶、膠原酶灌入肺內消化分離細胞；采用免疫貼附法純化細胞，巨噬細胞、淋巴細

6、胞和中性粒細胞等細胞表面有IgG的Fc段受體，將細胞懸液培養(yǎng)子覆被IgG的平皿中，有Fc段受體的細胞被粘附，而無Fc段受體的ATⅡ細胞得以純化。AT Ⅱ細胞的鑒定采用電子顯微鏡和SP-A免疫組化染色，其在電子顯微鏡下有特征性板層小體，免疫組化染色見細胞漿有SP-A表達。 實驗三：10只雄性SPF SD大鼠，采用膽胰管內逆行注入1.5％去氧膽酸鈉建立大鼠SAP時ALI模型，留取腹水，檢測腹水sPLA2活性后分裝，-80℃保存。按前

7、述方法分離、提取、培養(yǎng)ATⅡ細胞，腹水預處理按腹水終濃度為12.5 μl/ml、25μl/ml、50μl/ml和100μl/ml加入培養(yǎng)液，分6、12、24h三個時點，采用MTT法測定細胞增殖情況和細胞生存率。根據細胞增殖情況，選用腹水預處理濃度為25 μ l/ml，預處理時間24h，培養(yǎng)孔KH064干預終濃度為：0 μ g/ml、0.5 μ g/ml、1 μ g/ml、2 μ g/ml、4 μ g/ml，培養(yǎng)孔Emodin干預終濃度為

8、：0μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，用MTT法測定細胞增殖情況，根據實驗結果選擇藥物干預劑量為：KH0641μg/ml、2μg/ml，Emodin 10μg/ml，20μg/ml。腹水預處理組腹水劑量分別為：12.5、25、50、100μl/ml培養(yǎng)液，預處理時間為24h。腹水預處理組和藥物干預組分別提取RNA和蛋白，檢測SP-AmRNA和蛋白的表達。電子顯微鏡觀察ATⅡ細胞。 結果：

9、 SAP組血淀粉酶顯著高于SO組和各治療組(P<0.05)。SAP組PaO2、pH顯著低于SO組和治療組(P<0.05)，SAP組PaCO2、肺W/T顯著高于SO組和治療組(P<0.05)。SAP組血清sPLA2顯著高于SO組(P<0.05)，QYT、DEX、KH064組血sPLA2與SAP組比較有顯著降低(P<0.05)，SS組血sPLA2與SAP組比較差別無顯著性。SAP組SP-A mRNA表達較SO組顯著降低(P<0.05

10、)，QYT、DEX、KH064組SP-A mRNA表達較SAP組顯著增高(P<0.05)，SS組SP-A mRNA表達與SAP組比較無顯著變化。各組SP-AmRNA表達與肺損傷評分呈負相關(P<0.05)。SO組SP-A蛋白有明顯表達，與SO組比較，SAP組SP-A表達顯著降低，治療組與SAP組比較SP-A表達增高，其中QYT、DEX、KH064組增高明顯。肺組織免疫組化SAP組SP-A表達較SO組顯著降低(P<0.05)，各治療組SP

11、-A表達較SAP組有顯著增高(P<0.05)。與SO組比較SAP組sPLA2-Ⅱ mRNA、蛋白表達顯著增高，除SS組外其他各治療組sPLA2-Ⅱ mRNA、蛋白表達較SAP組顯著降低。治療組肺組織病理及電鏡改變較SAP組明顯好轉，以QYT、KH064組好轉明顯。 純化前可得約5×108個 ATⅡ細胞/只鼠，IgG免疫粘附純化后細胞數約為1.6×107個／只。臺盼藍染色顯示細胞活力為95％以上。通過SP-A免疫組化染色判定，純化

12、后ATⅡ細胞純度可達92％。 光學顯微鏡檢查見隨預處理腹水劑量增加，細胞生長狀態(tài)變差，并出現細胞死亡。KH064、Emodin干預組細胞生長良好。MTT結果顯示，腹水呈劑量依賴方式抑制大鼠ATⅡ細胞生長，細胞生存率隨培養(yǎng)時間的延長降低。KH064濃度為0.5-2μl/ml時，細胞增殖較對照組明顯增高，并呈劑量依賴性；Emodin濃度為10-40 μl/ml時，細胞增殖較對照組有顯著增高，并呈劑量依賴性。隨著干預腹水濃度的增高，A

13、TⅡ細胞SP-AmRNA的表達降低，表現出明顯的劑量依賴性。KH064和Emodin干預組SP-AmRNA的表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，各干預組不同劑量之間SP-AmRNA的表達水平無顯著差別(P>0.05)。腹水預處理組AT Ⅱ細胞SP-A蛋白表達顯著低于對照組，并隨腹水預處理劑量的增高SP-A的表達降低，呈現劑量依賴性。KH064和Emodin干預組AT Ⅱ細胞SP-A蛋白的表達水平顯著高于對照組。KH064和Emodi

14、n干預組AT Ⅱ細胞電子顯微鏡下改變較腹水預處理組明顯減輕。 結論： 急性胰腺炎肺損傷時，AT Ⅱ細胞結構破壞，導致SP-AmRNA表達減少，進而使肺表面活性物質中SP-A表達降低，其對sPLA2-Ⅱ抑制作用降低，使后者表達增高，從而加速肺泡表面活性物質磷脂水解，導致肺泡表面張力增加，肺泡萎陷，最終導致ARDS。SP-A和sPLA2-Ⅱ的平衡在急性胰腺炎肺損傷發(fā)生中起關鍵作用。中藥清胰湯在急性胰腺炎肺損傷時起保護AT Ⅱ

15、細胞的作用，增加肺組織SP-A表達，同時降低肺組織sPLA2-Ⅱ表達，具有維持肺泡表面活性物質的功能，從而保持良好肺泡表面張力，防止ALI。地塞米松可能通過減輕炎癥反應，間接增加肺組織SP-A的表達，降低肺組織sPLA2-Ⅱ的表達，實現保護肺功能的作用。善寧明顯降低急性胰腺炎血淀粉酶水平，對SP-A、sPLA2-Ⅱ表達無顯著影響。 分離、純化大鼠AT Ⅱ細胞時，合適的胰蛋白酶濃度及作用時間對細胞活性有重要作用，大鼠IgG粘附純化

16、可以得到高純度的AT Ⅱ細胞，可以通過電子顯微鏡觀察板層小體和免疫組化染色檢測細胞SP-A表達鑒定ATⅡ細胞。 胰腺炎腹水抑制ATⅡ細胞增殖，隨著腹水濃度增高、作用時間延長其對細胞增殖的抑制作用增強，表現出明顯劑量、時間依賴性。sPLA2-Ⅱ抑制劑可以減輕腹水對AT Ⅱ細胞的損傷，表明腹水中對細胞損傷起主要作用的物質可能是sPLA2-Ⅱ。Emodin也有減輕腹水對AT Ⅱ細胞的損傷作用，其可能主要通過抑制sPLA2-Ⅱ活性，減輕