P物質(zhì)在急性胰腺炎相關肺損傷中的作用.pdf

1、急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床上常見的急腹癥之一，特別是重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)并發(fā)癥多，預后兇險，病死率可高達30％～40％。急性肺損傷及其終末階段急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratory distress syndrome，ARDS)是AP最常見而嚴重的并發(fā)癥，為臨床SAP病人死亡的重要原因之一。 神經(jīng)激肽P物質(zhì)是神經(jīng)源性炎癥反應

2、中的重要介質(zhì)，在免疫反應中亦起著重要作用。近年來，P物質(zhì)在AP與其相關性肺損傷中的作用已被人們認識，并逐漸引起重視。已知P物質(zhì)是一種舒血管物質(zhì)，能增加血管通透性，導致血漿滲出與水腫。P物質(zhì)能夠誘導白細胞黏附與浸潤，還能調(diào)節(jié)多種細胞因子的產(chǎn)生并與T細胞增殖，B淋巴細胞產(chǎn)生抗體及單核巨噬細胞與肥大細胞釋放炎性介質(zhì)，多形核白細胞呼吸爆發(fā)等功能作用相關。P物質(zhì)主要是通過與相應神經(jīng)激肽受體(neurokinin-1 receptors，NK-1R

3、)結合，介導G蛋白偶聯(lián)的第二信號途徑而發(fā)揮作用的。研究發(fā)現(xiàn)，在AP過程中，P物質(zhì)釋放明顯增加，其相應NK-1R表達亦明顯增加。反映肺組織血漿、炎細胞滲出程度的肺濕/干重率明顯增加，作為反映中性粒細胞聚集程度指標的髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活力亦明顯增強。Lau等發(fā)現(xiàn)在雨蛙肽誘導的小鼠急性胰腺炎模型中通過腹腔給予P物質(zhì)受體拮抗劑CP-96,345可以降低血清淀粉酶水平，減輕胰腺與肺組織的水腫、出血、炎細胞浸潤等

4、病理損傷，降低MPO活性，降低微血管通透性，從而為AP相關性肺損傷的治療提供一新的途徑。目的： 本研究通過建立大鼠AP模型，并施予P物質(zhì)受體拮抗劑L-703,606干預，觀察肺組織的濕/干重比率，MPO活性，病理改變及P物質(zhì)與NK-1R的表達情況，探討其在AP炎癥反應中的作用，探討L-703,606對實驗性AP的治療作用及機制。 方法： 1動物模型的制備：選取雄性大鼠，以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，取上腹正中作切

5、口進入腹腔，用4號加工鈍頭頭皮靜脈針頭于十二指腸乳頭附近逆行插入胰膽管，以0.2ml/min速度注入5％?；悄懰徕c(0.1ml/100g)，推藥后捏閉胰膽管入十二指腸處，觀察3min，剪除除結扎線，關腹。 2實驗分組：將雄性Sprague-Dawley大鼠54只，隨機分為假手術組(SO組，n=18)、急性胰腺炎組(AP組，n=18)、急性胰腺炎治療組(AP+L-703,606組，n=18)，后又以不同時間點3h、6h、12h分為

6、三個亞組，每個亞組為6只大鼠。AP+L-703,606組于不同時間點造模前15min經(jīng)尾靜脈預防性注射L-703,606(250nmol/kg)。 3肺組織濕/干重率測定：取左肺葉，以吸水紙吸干表面液體，稱取濕重，置于60℃烤箱烤72h至恒重，稱取干重，計算濕/干重比率。 4生化指標測定：取血清樣本，采用全自動血清生化分析儀檢測血清淀粉酶、脂肪酶，由河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生化室協(xié)助測定。 5胰腺、肺組織學檢查：采用石蠟切片

7、，HE染色。 6 MPO活力測定：取肺組織制成組織勻漿，用化學比色法測定，具體操作按南京建成生物工程研究所提供的測試盒說明書進行。 7免疫組織化學染色：脫蠟至水，抗原熱修復后，用3％過氧化氫孵育15min。封閉一抗4℃過夜，陰性對照用PBS代替一抗。先后滴加二抗、三抗各15min，后用3,3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色，復染后封片。以細胞漿內(nèi)呈現(xiàn)黃褐色顆粒為陽性表達。 8 western blot：100mg肺組

8、織經(jīng)超聲細胞粉碎機徹底粉碎，加入1ml細胞裂解液，充分裂解，提取NK-1R膜蛋白(具體操作按說明書)，取20μg與上樣緩沖液充分混合，置于SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至NC膜，以5％的脫脂奶粉封閉，一抗(1:250)4℃孵育過夜，以相應的二抗室溫下孵育2h，抗體檢測按Santa Cruz公司試劑盒說明書進行。 結果： 1.大鼠胰腺的病理學變化：肉眼和光鏡所見SO組胰腺及周圍組織結構始終大致正常；AP組和AP+L-7

9、03,606組隨著時間的推移，胰腺及周圍組織水腫、出血和壞死面積逐漸擴大，程度逐漸加重，腹水也增多。 2大鼠肺組織的病理學變化：肉眼和光鏡所見SO組肺組織結構始終大致正常；AP組隨著時間的推移，肺組織水腫、充血、出血，肺萎陷與不張和炎細胞聚集面積逐漸擴大，程度逐漸加重；而AP+L-703,606組較AP組的組織結構損傷相對較輕。 3血清淀粉酶的變化：在各時間點，SO組無明顯變化，AP組及AP+L-703,606組與SO組比較均明

10、顯升高(P＜0.05)。 4血清脂肪酶的變化：在各時間點，SO組無明顯變化，AP組及AP+L-703,606組與SO組比較均明顯升高(P＜0.05)。AP+L-703,606組與AP組比較，12h時間點的脂肪酶升高(P＜0.05)。 5肺組織濕/干重比率：在各時點，SO組肺組織濕/干重比率在不同時間點無明顯變化，與SO組比較，AP組與AP+L-703,606組在各時點均明顯升高(P＜0.05)，與AP組比較，AP+L-7

11、03,606組在各時間點肺組織濕/干重比率明顯降低(P＜0.05)。 6 MPO活力的變化：SO組MPO活力在各時間點無明顯差異，與SO組比較，AP組與AP+L-703,606組MPO活力在各時點明顯增強(P＜0.05)。與AP組比較，AP+L-703，606，在各時間點MPO活力明顯降低(P＜0.05)。 7 P物質(zhì)在肺組織中的表達：SO組肺組織有弱的P物質(zhì)表達，AP組與AP+L-703,606組，在血管內(nèi)皮細胞，肺泡

12、上皮細胞，炎性細胞及肺間質(zhì)均有明顯增強的P物質(zhì)表達，免疫組化評分顯示AP+L-703,606組表達強度低于AP組(P＜0.05)。 8 NK-1R在肺組織中的表達：密度掃描分析示SO組肺組織有弱的NK-1R表達，AP組與AP+L-703,606組NK-1R表達明顯增強(P＜0.05)，AP+L-703,606組與AP組比較NK-1R表達無明顯改變。 結論： 1.逆行膽胰管內(nèi)注射5％牛磺膽酸鈉，通過檢測血清淀粉酶、

13、脂肪酶升高，胰腺組織HE染色觀察到胰腺及周圍組織水腫、出血和壞死，肺組織水腫、充血、出血、萎陷、不張與炎細胞浸潤等表現(xiàn)，證實大鼠AP相關性肺損傷模型制備成功。 2.在AP大鼠肺組織中，P物質(zhì)與其受體NK-1R的表達均明顯高于對照組，表明P物質(zhì)介導的信號轉導途徑在AP相關性肺損傷的發(fā)病機制中可能起作用。 3.L-703,606是強有力的NK-1R拮抗劑，能降低P物質(zhì)表達，降低肺組織濕/干重比率與MPO活力，改善肺組織病理損