Caveolin-1在脂多糖誘導的血管內皮細胞F-actin重組中的作用及機制.pdf

1、第一部分：篩選有效抑制血管內皮細胞caveolin-1表達的siRNA及其毒性檢測
　　目的:篩選有效抑制血管內皮細胞小窩蛋白-1（caveolin-1）表達的小干擾RNA（small interference RNA, siRNA）序列，并檢測轉染復合物的細胞毒性。
　　方法:設計合成針對caveolin-1的siRNA3條（siRNA422,siRNA548,siRNA710）及一條帶綠色熒光標記的通用陰性對照FAM-s

2、iRNA。在siRNAFect(siRNA transfection reagent)介導下轉染血管內皮細胞。用Real-Time PCR測定轉染后血管內皮細胞中caveolin-1 mRNA的表達，Western blot方法測定干擾后caveolin-1蛋白表達，比較抑制率，篩選出有效抑制caveolin-1表達的siRNA。采用磺基羅丹明B法(sulforhodamineB， SRB)分析轉染復合物的細胞毒性。
　　結果:①

3、在siRNAFect相同劑量下，siRNA20、30或40nmol?L-1組轉染效率均達到85%以上(P<0.01)；②siRNAFect1.3μL復合10或20nmol?L-1siRNA組細胞存活率均達到80%以上（P<0.05）；③siRNA548對EA.hy926細胞caveolin-1基因mRNA抑制效果最明顯(P<0.01);④與陰性對照組及siRNA422、siRNA710相比，siRNA548干擾血管內皮細胞48h后,ca

4、veolin-1蛋白的表達量最低(P<0.01)。
　　結論:① siRNA548對血管內皮細胞caveolin-1表達的抑制效果最大。② siRNA濃度20 nmol·L-1復合siRNAFect1.3μL轉染效率高，細胞毒性低，適合轉染。
　　第二部分：Caveolin-1通過NF-κB途徑調控LPS誘導血管內皮細胞F-actin的重組
　　目的:探討小窩蛋白-1（caveolin-1）在脂多糖（Lipopolys

5、accharides，LPS）誘導血管內皮細胞纖維狀肌動蛋白解聚中的作用及其可能的調節(jié)機制。
　　方法:以人臍靜脈內皮細胞株（EA.hy926細胞株）為研究對象，細胞生長穩(wěn)定貼壁融合后，根據(jù)不同的處理分為四組，每組6復孔：1）對照組（C組）；2）LPS10μg/ml組（L組）；3）LPS10ug/ml+cav-1-siRNA548預處理組（S組）；4) LPS10μg/ml+cav-1-siRNA548+L-NAME(N-硝基-L

6、-精氨酸甲酯)10μM預處理組（N組）。根據(jù)LPS的作用時間，每組進一步分為1、3、6和12小時組。使用Real-Time PCR測定各組peNOS-s1177和NF-κB的表達，同時采用直接免疫熒光染色法觀察各組F-actin的變化。
　　結果:（1）與對照組比較，各時間點L組和S組的peNOS-s1177表達均明顯增加（P<0.01），其中 S組 peNOS-s1177表達更為顯著（P<0.01）；與1h組比較，L組peNOS

7、-s1177在6h時達到最大值（P<0.01），12h時表達開始減少（P<0.05）；而在S組，peNOS-s1177在3h達到最大值（P<0.05），之后6h和12h表達逐漸減少（P<0.01）；（2）與對照組比較，各時間點L、S和N組的NF-κB表達均明顯增加（P<0.01），其中L和N組的NF-κB在各時間點增加更為顯著（P<0.01），而L組和N組之間表達無差異（P>0.05）。在S組，NF-κB在3、6和12h表達顯著降低（P

8、<0.01）；(3)直接熒光染色發(fā)現(xiàn)在給予LPS6h后，EA.hy926細胞株F-actin出現(xiàn)明顯的解聚和重構，其程度隨著時間的增加而加重。而采用cav-1-siRNA548預處理細胞株后，F(xiàn)-actin的解聚和重構發(fā)生時間明顯推遲且程度較輕，并且L-NAME可以逆轉上述作用。
　　結論:（1）caveolin-1參與了 LPS誘導血管內皮細胞 F-actin解聚的調控；（2）caveolin-1可能通過eNOS-NF-κB途徑