脂聯(lián)素對高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1表達(dá)的調(diào)控作用研究.pdf

1、目的：研究脂肪細(xì)胞因子脂聯(lián)素（APN）對高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）表達(dá)的影響及其機(jī)制，為2型糖尿病患者大血管病變的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　?。?）不同濃度D-葡萄糖(0、15、30、60mmol/L)作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC-12）48h后，倒置相差顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，Western Blotting檢測HUVEC-12中 LOX-1的蛋白表達(dá)，篩選最

2、佳葡萄糖濃度用于構(gòu)建高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞受損模型。
　?。?）用濃度30mmol/LD-葡萄糖作用于HUVEC-12不同時間（0、12、24、48、72h）后，倒置相差顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，Western Blotting檢測HUVEC-12中LOX-1的蛋白表達(dá)，篩選最佳葡萄糖作用時間用于建模。
　?。?）選取30mmol/L D-葡萄糖作用于HUVEC-1248h，造成D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-12內(nèi)皮功能受損模型；然

3、后，不同濃度的APN（0、10、20、40μg/m l）作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-1248h，倒置相差顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，Western Blotting檢測磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(p-ERK1/2)、核轉(zhuǎn)錄因子（NF）－κB和LOX-1蛋白表達(dá)，同時，篩選最佳保護(hù)作用的APN濃度。
　?。?）選取20μg/m l APN作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-12不同時間（0、12、24、48、72h）后，倒置相差

4、顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，Western Blotting檢測HUVEC-12中p-ERK1/2、NF－κB和LOX-1蛋白表達(dá)。同時，篩選最佳保護(hù)作用的APN作用時間。
　　（5）在20μg/ml APN作用48h后的D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-12中使用ERK1/2阻斷劑PD98059（50umol/l）干預(yù)，用Western Blotting檢測HUVEC-12中p-ERK1/2、NF－κB和LOX-1蛋白表達(dá),用間接免疫熒光

5、法檢測其核轉(zhuǎn)錄因子－κB亞基p65（NF－κB-p65）核轉(zhuǎn)位情況。
　　結(jié)果：
　　（1）不同濃度的D-葡萄糖誘導(dǎo)HUVEC-12不同時間，鏡下見內(nèi)皮細(xì)胞排列較為紊亂,折光性變?nèi)?，?xì)胞核模糊，細(xì)胞間隙明顯增大，細(xì)胞內(nèi)顆粒狀物增多；D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-12中LOX-1蛋白表達(dá)均上調(diào)，其中，30mmol/L D-葡萄糖作用于HUVEC-1248h，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變和LOX-1蛋白表達(dá)上調(diào)最明顯。
　?。?）不同濃

6、度APN作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-12不同時間，鏡下見內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改善，折光性有所增強(qiáng)，胞內(nèi)顆粒物減少，細(xì)胞排列相對規(guī)整；同時，APN可使D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-12內(nèi)LOX-1蛋白表達(dá)下調(diào)，NF－κB表達(dá)降低，ERK1/2磷酸化水平增強(qiáng)；其中20μg/ml APN作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-1248h后，作用最明顯。
　?。?）ERK阻斷劑PD98059和APN聯(lián)合干預(yù)下的D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-12中ER