高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞AE2表達的動態(tài)改變及機制.pdf

1、目的：建立體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)高糖損傷模型觀察陰離子交換蛋白-2(AE2)表達的動態(tài)改變，并從高級糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)途徑和ROS途徑探討AE2表達的機制。方法：在培養(yǎng)的HUVECs中，分別加入含不同濃度的葡萄糖(GLU，5.5Mm，17.8mM，35.6mM，71.2mM，142.4mM)和甘露醇(MNT，142.4mM)的DMEM(pH=7.4)孵育48h；另取一批細(xì)胞，用含35.6 mM葡萄糖的DMEM分別孵

2、育12h、24h、48h、72h、5d和7d后，收集細(xì)胞，采用RT-PCR和Western Blotting法分別檢測AE2 mRNA和AE2蛋白的表達的動態(tài)改變。在機制研究中，在35.6 mM葡萄糖溶液中分別加入AGEs形成抑制劑(AG，終濃度為5mM)和ROS生成抑制劑(MTZ，終濃度為1μM)處理細(xì)胞48h，檢測AE2 mRNA和AE2蛋白的表達改變及采用EMSA法測定相應(yīng)的各組AP1的DNA結(jié)合活性。結(jié)果：(1)MTT法檢測細(xì)胞

3、活力：與Control組比，葡萄糖濃度越高，細(xì)胞活力越低，相同葡萄糖濃度下培養(yǎng)時間越長細(xì)胞活力越低。MNT組與Control組比較，無顯著性差異。(2)高糖(HG)誘導(dǎo)AE2 mRNA和蛋白表達的濃度-效應(yīng)關(guān)系：AE2 mRNA表達水平先隨著葡萄糖濃度增加而增加，在35.6 mM和71.2mM達到最大，分別為5.5mM時的2.25和2.30倍，在142.4mM時，AE2 mRNA表達量降低，為5.5mM時的1.98倍，而142.4mM

4、MNT對AE2 mRNA表達無影響。AE2蛋白表達的改變與AE2mRNA表達變化類似。(3)HG誘導(dǎo)AE2mRNA和蛋白表達的時間過程：隨著35.6 mM GLU處理時間的延長，AE2 mRNA和蛋白的表達水平也隨之增加，48h達到最大，隨后表達量降低，到168h還維持較高水平。(4)抑制AGEs和ROS途徑可下調(diào)高糖誘導(dǎo)的AE2 mRNA和蛋白的表達：HG(35.6 mM)可上調(diào)AE2 mRNA和蛋白的表達水平，與Control(5.

5、5 mM)相比，具有顯著性差異；AG(5 mM)和MTZ(1μM)分別與GLU(35.6 mM)共孵育48 h，AE2 mRNA和蛋白的表達水平顯著降低，但與Control(5.5 mM)相比，無顯著性差異。(5)HG對AP-1與AE2基因啟動子特異序列結(jié)合活性的影響：HG(35.6mM)可明顯促進轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白AP1與AE2基因啟動子中特異序列結(jié)合，而AG(5 mM)和MTZ(1μM)明顯對抗HG誘導(dǎo)的AP1結(jié)合活性的升高。結(jié)論：高