Caveolin-1突變體在小鼠肝癌Hepa1-6細胞中的表達、定位及功能分析.pdf

1、背景與目的： Caveolae（胞膜窖）是細胞質(zhì)膜向內(nèi)凹陷的一種結(jié)構(gòu)，于1953年由G.E.Palade首次通過電子顯微鏡在毛細血管內(nèi)皮中發(fā)現(xiàn)。胞膜窖能夠介導(dǎo)胞吞、胞飲、膽固醇轉(zhuǎn)運和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。胞膜窖的標志性蛋白是窖蛋白家族（Caveolins），包括Caveolin-l（α，β），Caveolin-2（α，β，γ），Caveolin-3。其中Caveolin-1廣泛的存在于組織細胞中，Caveolin-2與Caveolin-1

2、的分布基本相同，Caveolin3主要位于肌細胞中。 研究表明Caveolin-1是細胞內(nèi)許多信號分子相互作用的樞紐，它可通過影響多種信號通路進而影響細胞的增殖、轉(zhuǎn)化、遷移和轉(zhuǎn)移、細胞生存與死亡等細胞行為。目前發(fā)現(xiàn)Cav-1具有磷酸化位點，棕櫚?；稽c[6]，跨膜區(qū)，腳手架區(qū)（CSD）等功能域，它們在細胞生物學(xué)行為中發(fā)揮著各自不同的作用。例如：Cav-1可通過CSD區(qū)域與相關(guān)蛋白作用，進而影響相關(guān)蛋白的活性。Cav-1的表達對c

3、aveolae形成形態(tài)學(xué)上的結(jié)構(gòu)起著必要的作用，且在caveolin-1存在的條件下，caveolae通過調(diào)節(jié)細胞對信號分子的攝取及信號的持續(xù)時間進一步影響其下游分子[11]。 CD147分子是一種糖基化的（glucosylated）免疫球蛋白超家族（immunoglobulin Superfamily，IGSF）成員，是具有單次跨膜結(jié)構(gòu)的糖蛋白。CD147為N-連接糖蛋白，其糖基化形式主要兩種，低糖基化（LG-CD147）和

4、高糖基化（HG-CD147，～32kDa），糖基化形式與腫瘤惡性程度及淋巴道轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)。CD147又稱為基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN），能夠誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在間質(zhì)和腫瘤細胞內(nèi)表達并分泌出來。大部分MMPs幾乎能夠降解細胞外基質(zhì)和基底膜的全部成分，在腫瘤侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的促進作用[12，13]。目前認為HG-C

5、D147在促進MMPs分泌和表達方面比LG-CD147具有更積極的作用。 本課題組研究結(jié)果表明，在小鼠肝癌細胞HCa-F（高淋巴道轉(zhuǎn)移）中Cav-1表達量高于HCa-P（低淋巴道轉(zhuǎn)移），而在Hepa1-6（無淋巴道轉(zhuǎn)移）中無Cav-1的表達，提示Cav-1在小鼠肝癌細胞淋巴道轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮作用。進一步通過RNA干擾下調(diào)Hca-F細胞中Cav-1的表達時，與對照相比，HG-CD147表達減少，LG-CD147表達增多；同時，MMP

6、s-11表達下調(diào)，細胞體外遷移及侵襲能力下降。 本文旨構(gòu)建Cav-1的不同功能域突變體重組真核表達載體，研究其在Hepal-6細胞中表達、細胞內(nèi)的定位及對CD147糖基化的影響。 方法： 1.突變Cav-1的14位磷酸化位點（記為Y14F），133，143和156位棕櫚酰化位點（記為C133A，C143A，C156A），刪除133-178位氨基酸（記為△133-178），刪除跨膜區(qū)102-134位氨基酸（記為△T

7、MD），并將突變體分別與 pMD18-T simple vector進行連接，記為 T/Cav-1（Y14F），T/Cav-1（C133A），T/Cav-1（C143A），T/Cav-1（C156A），T/Cav-1（△133-178），T/Cav-1（△TMD）。再經(jīng)轉(zhuǎn)化、抗生素初步篩選、限制性核酸內(nèi)切酶酶切和DNA測序獲得初步重組質(zhì)粒，再經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶酶切、瓊脂糖凝膠電泳、DNA純化，將純化的DNA產(chǎn)物與真核表達載體pcDNA

8、3.1連接，獲得Caveolin-1突變體重組質(zhì)粒分別記為pcDNA3.1/Cav-1（Y14F），pcDNA3.1/C av-1（C133A），pcDNA3.1/Cav-1（C143A），pcDNA3.1/Cav-1（C156A），pcDNA3.1/Cav-1（△133-178），pcDNA3.1/Cav-1（△TMD），進行DNA序列分析。 2.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將以上Caveolin-1突變體重組真核表達載體分別轉(zhuǎn)染至

9、小鼠肝癌細胞Hepal-6中，記為Hepal-6/Cav-1（Y14F），Hepal-6/Cav-1（C133A）Hepal-6/Cav-1（C143A），Hepal-6/Cav-1（C156A），Hepal-6/Cav-1（△TMD），Hepal-6/Cav-1（△133-178），以轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的Hepal-6細胞（記為Hepal-6/mock）與Hepal-6細胞作對照。 3.Western blotting

10、檢測瞬時轉(zhuǎn)染Caveolin-1及其突變體后，Hepal-6細胞內(nèi)CD147糖基化的改變。 結(jié)果： 1.經(jīng)XhoLI/EcoRI雙酶切和測序鑒定證實，成功構(gòu)建并獲得6種Caveolin-1突變體重組真核表達載體分別記為pcDNA3.1/Cav-1（Y14F），pcDNA3.1/Cav-1（C133A），pcDNA3.1/Cav-1（C143A），pcDNA3.1/Cav-1（C156A），pcDNA3.1/Cav-1（△

11、133-178），pcDNA3.1/Cav-1（△TMD）。 2.經(jīng)免疫細胞化學(xué)和Western blotting的方法證明，以上Caveolin-1突變體重組真核表達載體均能在Hepal-6細胞內(nèi)瞬時表達，并富集于胞漿內(nèi)，但Cav-1（Y14F）表達水平較低。 3.與Hepal-6/mock相比，Hepal-6/Cav-1（wt）及Hepal-6/Cav-1（Y14F）細胞中，LG-CD147基本消失；而轉(zhuǎn)染其余突變體

12、的細胞，LG-CD147和HG-CD147表達均未見顯著變化。 4.Cav-1（△TMD）蛋白表達在Hepal-6細胞內(nèi)36小時左右達高峰，但隨后蛋白表達量逐漸減少，至96小時完全消失：但是蛋白酶體抑制劑MG132處理使Cav-1（△TMD）蛋白表達增加。 結(jié)論： 1.構(gòu)建的6種小鼠Caveolin-1突變體重組真核表達載體pcDNA3.1/Cav-1（Y14F），pcDNA3.1/C av-1（C133A），p

13、cDNA3.1/Cav-1（C143 A），pcDNA3.1/Cav-1（C156A），pcDNA3.1/Cav-1（△133-178），pcDNA3.1/Cav-1（△TMD），在小鼠肝癌細胞Hepal-6中實現(xiàn)瞬時表達，其Caveolin-1突變體蛋白主要定位于細胞漿中。 2.Caveolin-1第14位酪氨酸磷酸化修飾沒有影響CD147的糖基化，但133，143，156位半胱氨酸的棕櫚?；揎?、跨膜區(qū)以及133-178位胞