CD147過表達對小鼠肝癌Hepa1-6細胞生物學功能的影響.pdf

1、背景與目的： 侵襲和轉移是惡性腫瘤最主要的生物學特性，也是腫瘤致死的重要因素。研究腫瘤轉移機制對腫瘤轉移的早期診斷和治療具有重要意義。腫瘤轉移的方式主要有淋巴道轉移、血道轉移和種植轉移。腫瘤發(fā)生淋巴道轉移的機制尚有待研究。研究表明，腫瘤轉移不僅與機體微環(huán)境有關，還與腫瘤細胞自身特性密切相關，其中細胞表面糖蛋白的糖基化調節(jié)起重要作用。 CD147分子，又名EMMPRIN，屬于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin

2、superfamily,IGSF)的跨膜糖蛋白，是細胞膜的監(jiān)視分子。CD147由2個胞外Ig結構域、1個跨膜結構域和1個胞內結構域組成。從CD147的N端起，第1個胞外Ig結構域與MMPs誘導活性及CD147自身寡聚有關；第2個胞外Ig結構域與窖蛋白Caveolin-1(Cav-1)存在相互作用。由于N-糖基化不同，CD147同時表現為高糖型CD147(HG-CD147，分子量40-66KD)和低糖型CD147(LG-CD147，分子量

3、33KD)，但CD147糖基化與腫瘤轉移的關系尚不明確。CD147主要通過誘導基質金屬蛋白酶活性參與組織重構，在機體發(fā)育、生殖等多種生理過程，以及腫瘤、類風濕關節(jié)炎、潰瘍等多種病理過程中發(fā)揮作用。另一方面，CD147已被證實在多種腫瘤尤其是惡性腫瘤組織中表達增加，目前CDl47已在肺癌、肝癌、腦膠質瘤、食道癌、喉癌、卵巢癌、乳腺癌等癌細胞中檢測出來。作為存在于腫瘤細胞表面的一種粘附分子，CD147介導腫瘤和基質之間的相互作用，誘導成纖維

4、細胞和腫瘤細胞自身MMPs生成，加速腫瘤血管的生成，從而促進腫瘤轉移。目前影響CD147水平表達活性的調節(jié)劑有糖基化、生長因子、激素和膜脫落等。其中，糖基化對CD147的誘導活性起關鍵性作用。 本文通過克隆小鼠CD147的cDNA、構建其表達載體并將其穩(wěn)定過表達于小鼠肝癌細胞Hepa1-6中，觀察CD147糖型和Hepa1-6細胞生物學的變化，旨在闡明CD147的糖基化及其調節(jié)在腫瘤轉移中的重要作用，為抗腫瘤轉移的藥物設計提供有

5、價值的實驗依據和線索。 方法： 1．從小鼠肝癌細胞HcaF中提取總RNA，利用CD147特異性引物經RT-PCR擴增CD147cDNA11-830bp片段，克隆至PMD18-T simple vector，然后亞克隆到真核表達載體質粒pcDNA3.1上，經轉化、抗生素初步篩選、限制性核酸內切酶酶切和DNA測序獲得重組質粒pcDNA3.1/CD147。 2．利用脂質體將重組質粒pcDNA3.1/CD147轉染至小鼠

6、肝癌細胞Hepa1-6上，空載體做對照，經G418篩選及RT-PCR和Western blot分析，獲得穩(wěn)定表達株。 3．Western blot分析穩(wěn)定過表達CD147的糖型變化，并利用體外侵襲實驗觀察小鼠肝癌細胞Hepa1-6細胞生物學性狀的變化。 結果： 1．利用RT-PCR從小鼠肝癌細胞HcaF總RNA中成功克隆出850bp的CD147cDNA的11-830bp片斷，重組陽性克隆經酶切和測序鑒定證實目的基

7、因已正確插入pcDNA3.1表達載體中，且與載體上的c-myc基因處于同一開放閱讀框，記為pcDNA3.1/CD147。 2．利用脂質體轉染技術，經G418篩選，RT-PCR、Western blot分析，獲得了2個穩(wěn)定過表達外源CD147的Hepa1-6細胞株，記為Hepa1-6/CD147。 3．CD147過表達的小鼠肝癌細胞Hepa1-6中，高糖型和低糖型CD147的表達均有增加，細胞的侵襲能力顯著增強。