TNF-α對(duì)小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響.pdf

1、[背景與目的]
　　 內(nèi)毒素休克等重癥感染性疾病的發(fā)病過(guò)程中，由于多種因素的作用，患者會(huì)發(fā)生絕對(duì)或相對(duì)腎上腺功能不全，導(dǎo)致臨床搶救成功率下降。TNF-α是一種重要的前炎癥介質(zhì)，是內(nèi)毒素休克等重癥疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中主要的炎癥介質(zhì)，可作用于下丘腦—垂體—腎上腺軸（HPA軸）的各個(gè)環(huán)節(jié)，影響腎上腺皮質(zhì)的功能。本課題組通過(guò)檢測(cè)TNF-α對(duì)小鼠腎上腺皮質(zhì)Y1細(xì)胞凋亡以及皮質(zhì)醇合成的影響，應(yīng)用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察Y1細(xì)胞的TN

2、F受體亞型的分布;應(yīng)用小RNA干擾法下調(diào)Y1細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)的TNF受體，探討TNF-α對(duì)干擾后Y1細(xì)胞凋亡以及皮質(zhì)醇合成的影響;從而明確小鼠腎上腺皮質(zhì)Y1細(xì)胞表面是否存在TNF-α受體，存在何種受體，以及TNF-α對(duì)Y1細(xì)胞的作用是否通過(guò)該受體發(fā)揮作用;初步探討TNF-α對(duì)Y1細(xì)胞凋亡和皮質(zhì)醇合成影響及其作用機(jī)理。研究結(jié)果可為臨床內(nèi)毒素休克等重癥感染性疾病的救治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1、應(yīng)

3、用流式細(xì)胞儀檢測(cè)TNF-α在不同劑量、不同作用時(shí)間對(duì)Y1細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)應(yīng)用酶標(biāo)法檢測(cè)Caspase8和Caspase3的變化，探討其對(duì)細(xì)胞凋亡通路的影響;
　　 2、應(yīng)用放免法檢測(cè)一定濃度的TNF-α或/和ACTH作用Y1細(xì)胞不同時(shí)間后對(duì)皮質(zhì)醇合成的影響;
　　 3、應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)一定濃度的TNF-α或/和ACTH作用Y1細(xì)胞不同時(shí)間后對(duì)皮質(zhì)醇合成限速酶---類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)表達(dá)的影響;

4、
　　 4、應(yīng)用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在mRNA和蛋白水平檢測(cè)Y1細(xì)胞表面TNF受體類型;
　　 5、小RNA干擾法下調(diào)Y1細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)的TNF受體，qPCR法和Western Blot法檢測(cè)干擾效果;
　　 6、應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)TNF-α在不同劑量、不同作用時(shí)間對(duì)TNFR-miRNA-Y1細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)應(yīng)用酶標(biāo)法檢測(cè)Caspase8和Caspase3的變化，觀察其在劑量、時(shí)間上對(duì)凋亡通路的影響

5、;
　　 7、應(yīng)用放免法檢測(cè)一定濃度的TNF-α或/和ACTH作用TNFR-miRNA-Y1細(xì)胞不同時(shí)間后對(duì)其皮質(zhì)醇合成的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 1、Y1細(xì)胞在100～250U/ml的TNF-α作用不同時(shí)間后，細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.05)，同時(shí)Caspase8和Caspase3的表達(dá)增強(qiáng)，呈劑量、時(shí)間依賴性(P＜0.05）;
　　 2、TNF-α單獨(dú)作用對(duì)Y1細(xì)胞皮質(zhì)醇合成的抑制不明顯(P＞0

6、.05)，ACTH可明顯促進(jìn)Y1細(xì)胞皮質(zhì)醇的合成(P＜0.05)，TNF-α與ACTH共同作用后，可明顯抑制Y1細(xì)胞由于ACTH介導(dǎo)的皮質(zhì)醇合成的增加(P＜0.05);
　　 3、RT-PCR結(jié)果顯示:TNF-α單獨(dú)作用對(duì)Y1細(xì)胞的StAR抑制作用不顯著（P＞0.05），ACTH單獨(dú)作用后StAR表達(dá)顯著上升(P＜0.05）。而TNF-α和ACTH共同作用Y1細(xì)胞StAR的表達(dá)受到抑制(P＜0.05);
　　 4、RT-

7、PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:Y1細(xì)胞TNFR1mRNA和蛋白表達(dá)陽(yáng)性，TNFR2mRNA和蛋白表達(dá)陰性;
　　 5、檢測(cè)小RNA抑制TNFR1后的TNFR-miRNA-Y1細(xì)胞干擾效率為71.74％，WesternBlot顯示TNFR-miRNA-Y1細(xì)胞TNFR1表達(dá)水平明顯下降;
　　 6、TNF-α對(duì)TNFR-miRNA-Y1細(xì)胞凋亡無(wú)明顯促進(jìn)作用(P＞0.05)，對(duì)Caspase8/3活性也無(wú)明顯影響(P＞0.

8、05);
　　 7、放免結(jié)果顯示:ACTH可明顯促進(jìn)TNFR-miRNA-Y1細(xì)胞皮質(zhì)醇的合成(P＞0.05)，TNF-α與ACTH共同作用后，對(duì)TNFR-miRNA-Y1細(xì)胞ACTH介導(dǎo)的皮質(zhì)醇合成的無(wú)明顯影響(P＞0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 1、TNF-α能夠誘導(dǎo)Y1細(xì)胞的凋亡，并呈劑量時(shí)間依賴關(guān)系;這種凋亡誘導(dǎo)作用可能是通過(guò)激活Caspase8和Caspase3通路實(shí)現(xiàn)的;
　　 2、TNF

9、-α單獨(dú)作用對(duì)Y1細(xì)胞的皮質(zhì)醇合成和StAR的影響不顯著;ACTH單獨(dú)作用能夠促進(jìn)Y1細(xì)胞皮質(zhì)醇的合成和StAR的表達(dá);TNF-α與ACTH共同作用可能通過(guò)下調(diào)StAR的表達(dá)而抑制Y1細(xì)胞ACTH介導(dǎo)的皮質(zhì)醇的合成;
　　 3、從蛋白、mRNA水平證實(shí)，Y1細(xì)胞以表達(dá)TNFR1為主;
　　 4、TNF-α對(duì)干擾后的TNFR-miRNA-Y1細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)激酶Caspase8和Caspase3無(wú)明顯影響;同時(shí)TNF-α