TNF-α對小鼠腎上腺皮質(zhì)細胞生物學(xué)功能的影響.pdf

1、[背景與目的]
　　 內(nèi)毒素休克等重癥感染性疾病的發(fā)病過程中，由于多種因素的作用，患者會發(fā)生絕對或相對腎上腺功能不全，導(dǎo)致臨床搶救成功率下降。TNF-α是一種重要的前炎癥介質(zhì)，是內(nèi)毒素休克等重癥疾病發(fā)生發(fā)展過程中主要的炎癥介質(zhì)，可作用于下丘腦—垂體—腎上腺軸（HPA軸）的各個環(huán)節(jié)，影響腎上腺皮質(zhì)的功能。本課題組通過檢測TNF-α對小鼠腎上腺皮質(zhì)Y1細胞凋亡以及皮質(zhì)醇合成的影響，應(yīng)用RT-PCR和免疫細胞化學(xué)方法觀察Y1細胞的TN

2、F受體亞型的分布;應(yīng)用小RNA干擾法下調(diào)Y1細胞中陽性表達的TNF受體，探討TNF-α對干擾后Y1細胞凋亡以及皮質(zhì)醇合成的影響;從而明確小鼠腎上腺皮質(zhì)Y1細胞表面是否存在TNF-α受體，存在何種受體，以及TNF-α對Y1細胞的作用是否通過該受體發(fā)揮作用;初步探討TNF-α對Y1細胞凋亡和皮質(zhì)醇合成影響及其作用機理。研究結(jié)果可為臨床內(nèi)毒素休克等重癥感染性疾病的救治提供一定的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1、應(yīng)

3、用流式細胞儀檢測TNF-α在不同劑量、不同作用時間對Y1細胞凋亡的影響，同時應(yīng)用酶標法檢測Caspase8和Caspase3的變化，探討其對細胞凋亡通路的影響;
　　 2、應(yīng)用放免法檢測一定濃度的TNF-α或/和ACTH作用Y1細胞不同時間后對皮質(zhì)醇合成的影響;
　　 3、應(yīng)用RT-PCR檢測一定濃度的TNF-α或/和ACTH作用Y1細胞不同時間后對皮質(zhì)醇合成限速酶---類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)表達的影響;

4、
　　 4、應(yīng)用RT-PCR和免疫細胞化學(xué)技術(shù)在mRNA和蛋白水平檢測Y1細胞表面TNF受體類型;
　　 5、小RNA干擾法下調(diào)Y1細胞中陽性表達的TNF受體，qPCR法和Western Blot法檢測干擾效果;
　　 6、應(yīng)用流式細胞儀檢測TNF-α在不同劑量、不同作用時間對TNFR-miRNA-Y1細胞凋亡的影響，同時應(yīng)用酶標法檢測Caspase8和Caspase3的變化，觀察其在劑量、時間上對凋亡通路的影響

5、;
　　 7、應(yīng)用放免法檢測一定濃度的TNF-α或/和ACTH作用TNFR-miRNA-Y1細胞不同時間后對其皮質(zhì)醇合成的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 1、Y1細胞在100～250U/ml的TNF-α作用不同時間后，細胞凋亡率明顯增加(P＜0.05)，同時Caspase8和Caspase3的表達增強，呈劑量、時間依賴性(P＜0.05）;
　　 2、TNF-α單獨作用對Y1細胞皮質(zhì)醇合成的抑制不明顯(P＞0

6、.05)，ACTH可明顯促進Y1細胞皮質(zhì)醇的合成(P＜0.05)，TNF-α與ACTH共同作用后，可明顯抑制Y1細胞由于ACTH介導(dǎo)的皮質(zhì)醇合成的增加(P＜0.05);
　　 3、RT-PCR結(jié)果顯示:TNF-α單獨作用對Y1細胞的StAR抑制作用不顯著（P＞0.05），ACTH單獨作用后StAR表達顯著上升(P＜0.05）。而TNF-α和ACTH共同作用Y1細胞StAR的表達受到抑制(P＜0.05);
　　 4、RT-

7、PCR和免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示:Y1細胞TNFR1mRNA和蛋白表達陽性，TNFR2mRNA和蛋白表達陰性;
　　 5、檢測小RNA抑制TNFR1后的TNFR-miRNA-Y1細胞干擾效率為71.74％，WesternBlot顯示TNFR-miRNA-Y1細胞TNFR1表達水平明顯下降;
　　 6、TNF-α對TNFR-miRNA-Y1細胞凋亡無明顯促進作用(P＞0.05)，對Caspase8/3活性也無明顯影響(P＞0.

8、05);
　　 7、放免結(jié)果顯示:ACTH可明顯促進TNFR-miRNA-Y1細胞皮質(zhì)醇的合成(P＞0.05)，TNF-α與ACTH共同作用后，對TNFR-miRNA-Y1細胞ACTH介導(dǎo)的皮質(zhì)醇合成的無明顯影響(P＞0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 1、TNF-α能夠誘導(dǎo)Y1細胞的凋亡，并呈劑量時間依賴關(guān)系;這種凋亡誘導(dǎo)作用可能是通過激活Caspase8和Caspase3通路實現(xiàn)的;
　　 2、TNF

9、-α單獨作用對Y1細胞的皮質(zhì)醇合成和StAR的影響不顯著;ACTH單獨作用能夠促進Y1細胞皮質(zhì)醇的合成和StAR的表達;TNF-α與ACTH共同作用可能通過下調(diào)StAR的表達而抑制Y1細胞ACTH介導(dǎo)的皮質(zhì)醇的合成;
　　 3、從蛋白、mRNA水平證實，Y1細胞以表達TNFR1為主;
　　 4、TNF-α對干擾后的TNFR-miRNA-Y1細胞凋亡及凋亡相關(guān)激酶Caspase8和Caspase3無明顯影響;同時TNF-α