擬南芥隱花素CRY1在亞細胞結構的功能分析及激活標簽突變體庫的構建.pdf

1、植物生長發(fā)育過程受到多種外界環(huán)境因素影響，光作為主要的環(huán)境因子，不僅提供光合作用所需能量，而且在植物光形態(tài)建成等多個過程中起重要調節(jié)作用。
　　 高等植物進化具備了一套極其精細的光感受和信號轉換系統(tǒng)，以監(jiān)視光信號的方向、量和質，并調節(jié)植物的生長發(fā)育。大量研究表明，藍光受體隱花素CRY1 在介導藍光調控植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用，包括抑制下胚軸伸長、刺激子葉展開、氣孔開啟、花青素的積累以及調節(jié)相關基因的表達等。隨著研究的深入

2、，進一步研究隱花素CRY1 在亞細胞結構中的生物學功能以及分離、鑒定與隱花素信號傳導相關的組分對闡明其作用機制十分重要。本論文通過不同的光處理，探討隱花素CRY1 在植物亞細胞中的定位及受光誘導轉移的過程。在此基礎上，以隱花素cry1-304 突變體為研究背景構建CRY1-GR/cry1-304 轉基因植株，采用外源糖皮質激素控制隱花素CRY1 在細胞核--細胞質間的分布，以期闡明隱花素CRY1 在亞細胞結構中的生物學功能。最后，以隱花

3、素cry1cry2 突變體為研究背景構建了激活標簽突變體庫，分離、鑒定與隱花素下游信號轉導相關的組分。通過遺傳、分析等方法，主要取得以下結果：
　　 1.將35S::CRY1-GFP 轉基因植株在黑暗中培養(yǎng)5天后，采用不同的光處理，實時觀察CRY1-GFP 融合蛋白在亞細胞中的定位及受光誘導轉移過程。實驗發(fā)現：
　　 黑暗條件下CRY1-GFP 融合蛋白定位在細胞質中且熒光強度非常微弱；隨著藍光處理時間的延長和光強的增大

4、，GFP 熒光逐漸增強，在亞細胞結構（細胞膜、細胞質、細胞核）中均有表達，實驗表明CRY1蛋白表達受藍光誘導，且與光照時間和強度成正比。在藍光處理過程中（0-15 min），CRY1-GFP 融合蛋白從細胞質、細胞膜向細胞核內轉移聚集；藍光處理15 min 時，細胞核中GFP 熒光強度達到最高，且細胞核與細胞GFP 平均熒光強度的比值達到峰值。蛋白免疫雜交結果進一步證實，在藍光下（0-15 min）GFP蛋白表達與藍光處理時間成正比。實

5、驗首次發(fā)現：CRY1-GFP 融合蛋白在藍光誘導下，由細胞質、細胞膜向細胞核內轉移累積，這種轉移與紅光無關。
　　 2.將黑暗中培養(yǎng)5天的野生型黃化苗采用不同的光照處理30 min，提取細胞核蛋白。蛋白免疫雜交檢測隱花素CRY1蛋白表達量顯示：藍光下，細胞核內CRY1蛋白表達量比黑暗、紅光高，黑暗條件下CRY1蛋白表達量最低。結果進一步證實細胞核內隱花素CRY1蛋白特異性受藍光誘導表達，或CRY1蛋白受藍光誘導完成由細胞質、細胞

6、膜向細胞核的轉移過程。3.以隱花素cry1-304 突變體為研究背景，成功構建了CRY1-GR/cry1-304 轉基因植株。實驗發(fā)現：CRY1-GR/cry1-304 轉基因植株僅在藍光和外源糖皮質激素同時存在的條件下回復野生型表型，包括抑制下胚軸的伸長、子葉的展開、花青素的累積及氣孔的開啟等。實驗證實：核定位信號（NLS）和光子激活兩要素是隱花素CRY1 在細胞核中發(fā)揮生理功能的充分必要條件。實驗首次將糖皮質受體GR作用機理運用到隱

7、花素CRY1基因功能研究，并證實細胞核隱花素CRY1 與下胚軸的伸長、氣孔的開啟相關；細胞質隱花素CRY1 與子葉的展開、葉柄的伸長和花青素的積累相關。
　　 4.以隱花素cry1cry2突變體為研究背景，構建了基因功能獲得型T-DNA突變體庫，獲得了近2 000個獨立轉化株系。從T1代轉基因植株中篩選獲得35個株系，與cry1cry2突變體表型明顯不同。從中篩選得到一組有價值的光周期開花突變體，為進一步研究隱花素與植物光形態(tài)建

8、成提供了寶貴實驗材料。采用IPCR法，成功獲得了Scc101-D突變體基因組T-DNA插入位點旁鄰序列。實驗發(fā)現，Scc101-D突變體晚花的表型是與At5g28237基因超量表達相關。
　　 5.以野生型為研究背景構建AT5G28237過量表達轉基因植株，該轉基因植株開花延遲，進一步證實Scc101-D突變體晚花表型是由AT5G28237基因超量表達所致。
　　 基因槍轟擊洋蔥表皮實驗首次發(fā)現該基因定位在細胞質中，且無