棉花Ac-Ds標(biāo)簽突變體庫構(gòu)建.pdf

1、棉花是一種重要的經(jīng)濟作物，近年來遭受干旱、蟲災(zāi)等災(zāi)害影響較大，急需培育新的品種來抵抗這些生物和非生物脅迫。目前棉花育種主要采用傳統(tǒng)的雜交育種手段，這種方法受到周期長、性狀不易發(fā)現(xiàn)等因素影響，很難快速的培育出新品種。植物基因工程技術(shù)在棉花育種上得到成功的應(yīng)用。然而，目的基因的克隆是制約棉花生物技術(shù)育種的主要因素。突變體為研究基因功能和克隆基因提供了很大的便利，這就要求我們建立棉花突變體庫，進而篩選相關(guān)突變體，培育棉花新品種。棉花遺傳轉(zhuǎn)化方

2、法的建立也為運用生物學(xué)方法建立突變體庫提供可能。
　　 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法是克隆新基因的一種有效方法，它利用轉(zhuǎn)座因子插入高等植物基因組中造成基因失活，通過分析轉(zhuǎn)座因子插入位點的旁鄰序列，進而克隆該基因。利用Ac/Ds標(biāo)簽系統(tǒng)構(gòu)建插入突變體庫是較為理想的方法。將玉米中發(fā)現(xiàn)的Ac/Ds轉(zhuǎn)座元件構(gòu)建成雙元載體系統(tǒng)，利用已成熟的棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)（農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，基因槍轟擊法和花粉管通道法），將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)到棉花基因組中，構(gòu)建棉花的Ac/Ds標(biāo)簽突變體

3、庫。
　　 通過試驗，優(yōu)化了棉花農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化程序。以生長一周的棉花無菌苗的下胚軸為外植體，MSB5添加0.1 mg/L的IAA、KT和2,4-D為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，能較好的誘導(dǎo)出愈傷組織。3-4周繼代一次，繼代培養(yǎng)基保持IAA濃度為0.1 mg/L不變，KT和2,4-D的濃度均比前一次繼代培養(yǎng)的濃度降低0.01 mg/L。通過3-4次繼代，可獲得胚性愈傷。已經(jīng)獲得品種Coker413的胚性愈傷，正在誘導(dǎo)分化成苗。
　　 運

4、用花粉管注射法獲得了轉(zhuǎn)Ac/Ds轉(zhuǎn)座元件的轉(zhuǎn)基因棉花。通過質(zhì)粒濃度梯度和質(zhì)粒種類對坐桃率的影響因素試驗，表明最佳質(zhì)粒注射濃度為0.02 μg/μL，而質(zhì)粒種類對坐桃率沒有影響。已經(jīng)獲得了36父本的轉(zhuǎn)基因植株。14株轉(zhuǎn)化Ac轉(zhuǎn)座酶植株和3株轉(zhuǎn)化Ds轉(zhuǎn)座元件植株，可用做雜交，建突變體庫。
　　 本研究將玉米Ac/Ds轉(zhuǎn)座元件構(gòu)建的雙元載體分別導(dǎo)入陸地棉36父本等品種中，利用Ds的可控轉(zhuǎn)座，構(gòu)建陸地棉Ac/Ds標(biāo)簽插入突變體庫，為棉花