水稻osmgd2-1a突變體的功能互補(bǔ)及相關(guān)基因表達(dá)變化的分析.pdf

1、在真核生物中，生物膜系統(tǒng)對(duì)于其生命活動(dòng)不可或缺，其脂質(zhì)二層膜把膜內(nèi)外的環(huán)境分隔開來，使各反應(yīng)可以有條不紊的發(fā)生，同時(shí)膜脂結(jié)構(gòu)也使細(xì)胞膜能維持其特殊的結(jié)構(gòu)和功能。非磷脂質(zhì)單半乳糖二?；视王ィ╩onogalactosyldiacylglycerol，MGDG）和雙半乳糖二?；视椭╠igalactosyldiacylglycerol，DGDG）是質(zhì)體的主要膜脂質(zhì)。MGDG的生物合成的過程，是由MGDG合成酶（UDP-galactose:

2、sn-1,2-DAG3-β-galactosyltransferaseor MGDG synthase，MGD）催化一個(gè)半乳糖基從供體尿苷二磷酸半乳糖（UDP-Gal）轉(zhuǎn)移到sn-1,2-二?；视偷奈恢谩６鳧GDG的合成是以MGDG為底物進(jìn)行的，所以MGDG合成酶是半乳糖脂生物合成和質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)合成的關(guān)鍵酶。
　　前期啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)和定量PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：OsMGD2偏愛在二核和成熟期的花粉中表達(dá)；針對(duì)OsMGD2的

3、RNA干涉實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：干涉植株呈現(xiàn)花粉發(fā)育異常，花粉可染率下降的表型，推測 OsMGD2在水稻花粉后期發(fā)育過程中起作用。本研究在上述已有研究基礎(chǔ)上，通過OsMGD2啟動(dòng)子區(qū)T-DNA插入突變體osmgd2-1a的基因功能互補(bǔ)及過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步對(duì)OsMGD2基因在水稻花粉發(fā)育中的功能進(jìn)行驗(yàn)證和分析；通過對(duì)突變體的基因芯片分析，了解 OsMGD2表達(dá)下調(diào)時(shí)，與其相關(guān)的代謝途徑其它基因表達(dá)變化的情況。本論文的主要研究結(jié)果如下：
　　

4、1．通過雙引物法鑒定T-DNA插入突變體osmgd2-1的基因型，分析了兩代三批材料總計(jì)170株，結(jié)果顯示雜合突變體（116株）：純合野生型（54株）=2.15:1，未分離得到純合突變體。
　　2.觀察了突變體osmgd2-1 T4至T5代成熟花粉KI-I2染色及結(jié)實(shí)率的情況，發(fā)現(xiàn)雜合突變體osmgd2-1的花粉可染率和結(jié)實(shí)率均存在a/b兩種情況：osmgd2-1a，與中花11相比，花粉可染率下降至55％~60%，結(jié)實(shí)率下降至40

5、%~50%，差異顯著；osmgd2-1b，花粉可染率和結(jié)實(shí)率與中花11對(duì)照無明顯差異。結(jié)合黃任平（2013）T1-T3代結(jié)實(shí)率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，總體結(jié)果顯示突變體T1至T5代osmgd2-1a所占比例呈逐代增多，而osmgd2-1b植株所占比例呈逐代遞減的趨勢。
　　3．取二孢時(shí)期的穎花為材料，進(jìn)行了基因芯片轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析，與中花11（對(duì)照）相比，突變體osmgd2-1a中上調(diào)表達(dá)2倍以上的基因有308個(gè)，下調(diào)表達(dá)2倍以上的基因有117

6、個(gè)。表達(dá)差異基因的聚類和富集分析結(jié)果顯示，變化基因主要集中在細(xì)胞質(zhì)膜成分、核糖核酸成分，細(xì)胞生長發(fā)育，核酸轉(zhuǎn)錄過程等相關(guān)途徑。
　　4．將OsMGD2自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的OsMGD2功能互補(bǔ)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入突變體osmgd2-1a，獲得了功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)化植株4個(gè)株系（H1-1、H1-2、H9-1和H9-2），共16株。采用熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)所獲得的功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)化苗二孢期穎花OsMGD2表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示：T1代除H1

7、-1外，H1-2、H9-1和H9-2的OsMGD2表達(dá)量低于中花11對(duì)照，但較突變體osmgd2-1a有顯著的增加；T0代和T1代H1-2、H9-1和H9-2三個(gè)株系的花粉可染率，相對(duì)于突變體osmgd2-1a也均有了明顯的增加。上述功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：克隆的OsMGD2自身啟動(dòng)子，雖然沒有能讓功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)化株中OsMGD2表達(dá)恢復(fù)到對(duì)照中花11中的表達(dá)水平，但也驗(yàn)證了OsMGD2表達(dá)水平的部分恢復(fù)，與花粉可染率表型恢復(fù)呈正相關(guān)，表明水

8、稻中偏愛在二核和成熟花粉中表達(dá)的OsMGD2，確實(shí)在花粉的發(fā)育成熟過程中起作用。
　　5．將ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的OsMGD2過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入受體中花11，獲得了過表達(dá)轉(zhuǎn)化植株3個(gè)株系（G2、G4、G5），共11株。對(duì)所獲得的OsMGD2過表達(dá)轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行了熒光定量PCR檢測和表型觀察分析。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，過表達(dá)轉(zhuǎn)化苗葉子的OsMGD2的表達(dá)水平和過表達(dá)轉(zhuǎn)化苗二孢期穎花 OsMGD2的表達(dá)水平都顯著提高，但是