自噬在斑馬魚細胞冷應激過程中的作用機制研究.pdf

1、自噬（Autophagy，自體吞噬）是指吞噬細胞內蛋白或細胞器并進行降解的過程。當生物應對不良環(huán)境（如：營養(yǎng)缺乏等）時，可以通過分解細胞內一些非重要的蛋白及細胞器來維持細胞的存活。也有報道當負面的影響因素持續(xù)存在時，自噬過強則會誘導細胞發(fā)生凋亡或者壞死。雖然自噬的機制和作用研究已經有大量報道，但是自噬的這種機制應用于南極魚類抗寒抗凍方面的研究卻甚少，探討魚類抗寒抗凍與自噬之間的相關性是研究魚類抗寒機制的一個新領域，對于更全面地研究魚類抗

2、寒機制有著重要意義。
　　本研究通過在細胞中過表達自噬特異性標志物GFP- LC3（微管相關蛋白1輕鏈3，microtubule-associated protein1 light chain3）以觀察低溫環(huán)境下自噬的發(fā)生來探討自噬與細胞抗寒的關系。運用pEGFP-LC3、mCherry-hLC3B-pcDNA3.1重組質粒用于表達融合蛋白GFP-LC3及mChenry-LC3，并將其轉染于斑馬魚胚胎成纖維樣 ZF4細胞中，分別設

3、正常與低溫處理兩組；低溫處理后多個觀察點顯微鏡下觀察野生型細胞低溫處理與正常培養(yǎng)細胞的自噬小體形成的情況，與溶酶體共定位排除了由于低溫造成膜流動性變差引起的熒光點聚集，證明了低溫能夠誘導ZF4細胞發(fā)生自噬。對低溫處理24 h的ZF4細胞內的自噬上游調控基因beclin1與標記基因LC3進行RT-QPCR檢測，證明低溫可以引起細胞內自噬相關基因表達上調，對低溫下處理1-13 d的ZF4細胞內的LC3蛋白進行western blot檢測，發(fā)

4、現低溫脅迫下，細胞內LC3I轉換為LC3II的進程加快，且10℃處理下的細胞內的這個過程較18℃明顯快速，證明了冷刺激下細胞內自噬的發(fā)生。對低溫脅迫下細胞內的自噬水平以及細胞的存活率進一步的動態(tài)監(jiān)測顯示：不同程度的急性冷刺激下，ZF4細胞內的自噬出現不同程度的上調，其上調程度與低溫脅迫程度密切相關，同時發(fā)現ZF4細胞自噬出現的時間與開始死亡的時間之間似乎有著一定的聯系。為了知道自噬在細胞受到急性冷刺激后的作用機制，通過bafilomyc

5、in A1對自噬進行特異性的阻斷并給予急性冷刺激，存活率檢測發(fā)現自噬特異性阻斷后，細胞的存活率顯著下降。隨后，我們設計了自噬上游基因beclin1的shRNA，對細胞內的beclin1基因進行敲降并給予冷刺激下，存活率檢測顯示，急性冷刺激下，自噬被抑制的ZF4細胞的存活率較野生型明顯降低，證明了急性冷刺激下自噬對細胞的保護作用。為了進一步驗證低溫刺激下自噬的功能，過表達beclin1后給予細胞不同程度的低溫刺激并統(tǒng)計其存活率，結果發(fā)現，

6、過表達beclin1的ZF4細胞的存活率明顯上調，即自噬上調的細胞有更強的低溫耐受力，證明了自噬在低溫下對細胞的保護作用。
　　基于已發(fā)現的饑餓條件下自噬與ROS之間的關系，通過探討低溫下自噬與ROS之間的關系，來了解低溫下自噬的發(fā)生機制及作用功能。在急性冷刺激下，用藥物NAC(N-乙?；?L-半胱氨酸)清除細胞內ROS(活性氧)后監(jiān)測細胞內的自噬情況，發(fā)現ROS清除后，細胞內檢測不到自噬小體的發(fā)生，即低溫刺激下細胞內的自噬是由R

7、OS誘導的。bafilomycin A1阻斷低溫脅迫下細胞內的自噬，并用DCFH-DA染色及流式細胞儀檢測細胞內的ROS水平，結果顯示，自噬被阻斷后，細胞內的ROS水平明顯上調，即自噬參與了低溫下細胞內ROS的清除，綜上結果發(fā)現，在急性冷刺激下，ZF4細胞內的自噬與ROS為負反饋調節(jié)模式，ROS誘導ZF4細胞發(fā)生自噬，自噬則反過來清除細胞內的ROS。鑒于ROS來源于受損傷的線粒體，而ROS又與自噬相互作用，為了了解自噬與線粒體之間的關系

8、，對低溫下自噬小體與線粒體進行共定位并給予低溫刺激，發(fā)現斑馬魚內的自噬小體與線粒體發(fā)生了一定程度的共定位，說明低溫下，自噬參與了損傷線粒體的清除。將低溫脅迫下的細胞用藥物bafilomycin A1對自噬進行阻斷，對線粒體進行mitotracker染色并經流式細胞儀檢測，發(fā)現自噬阻斷后，細胞內的線粒體含量明顯較未阻斷的細胞上調，進一步證明了自噬小體清除線粒體的作用。
　　綜上，本研究證明了低溫可以誘導ZF4細胞內的線粒體發(fā)生損傷并