mTOR及自噬相關(guān)通路在腦衰老過程中的作用.pdf

1、研究目的:
　　衰老是引起認(rèn)知功能增齡性下降和神經(jīng)退行性疾病的主要原因。隨人口老齡化問題的日趨嚴(yán)重，神經(jīng)退行性疾病發(fā)病人數(shù)逐年增加，嚴(yán)重影響著患者及其家庭的生活質(zhì)量。但神經(jīng)退行性疾病目前在臨床上仍缺乏有效的治療方法，因此，預(yù)防或延緩神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展已成為當(dāng)務(wù)之急，對正常大腦老化機(jī)制的研究無論是對于神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防還是治療均具有重要意義。
　　自噬在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制及維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)元作為有

2、絲分裂后期細(xì)胞不能通過增生實(shí)現(xiàn)更新，主要依靠自噬來維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。抑制自噬活性可誘發(fā)包括早老性癡呆(Alzheimer's disease，AD)在內(nèi)的多種衰老相關(guān)神經(jīng)退行性疾病，但部分研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)退行性病變組織中存在自噬增強(qiáng)現(xiàn)象，因此，研究機(jī)體自然衰老過程中神經(jīng)細(xì)胞自噬活性的增齡性變化規(guī)律揭示神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生機(jī)制具重要意義。另外，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路

3、對自噬的抑制在自噬調(diào)控過程中起主導(dǎo)作用，細(xì)胞mTOR信號通路的過度激活進(jìn)而對自噬的抑制與AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。由于衰老是誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病的主要原因之一，因此推測，腦神經(jīng)細(xì)胞mTOR信號通路活性可能隨年齡增長而逐漸升高并伴隨自噬活性的增齡性下降;但另有研究證明，維持mTOR信號通路的活躍對神經(jīng)元樹突發(fā)生以及突觸間連接和記憶形成是必不可少的。據(jù)此，為滿足神經(jīng)發(fā)育的需要，幼年期神經(jīng)細(xì)胞mTOR信號通路活性應(yīng)高于老年期，但該假設(shè)

4、又與前述假設(shè)不符。因此研究腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞mTOR信號通路以及自噬活性的增齡性變化規(guī)律對于我們探索大腦衰老機(jī)制具有重要價(jià)值。
　　限制飲食中熱量供給(caloric restriction，CR)是目前公認(rèn)的延長壽命、預(yù)防衰老相關(guān)疾病的有效方法，因此CR干預(yù)被作為研究衰老和衰老相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的常用手段。抑制mTOR信號通路進(jìn)而激活自噬被認(rèn)為在CR延緩衰老過程中發(fā)揮重要作用。近年來亦有研究發(fā)現(xiàn)CR可以有效延緩認(rèn)知功能增齡性下降，但是其

5、是否是通過抑制細(xì)胞mTOR信號通路進(jìn)而激活自噬而實(shí)現(xiàn)未見研究報(bào)道。
　　本研究旨在探索海馬神經(jīng)元細(xì)胞mTOR及自噬相關(guān)信號通路活性的增齡性變化規(guī)律以及CR對其影響，進(jìn)而評價(jià)mTOR相關(guān)性自噬在大腦衰老以及CR延緩大腦衰老過程中的作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.建立1.5月齡、3月齡、12月齡、20月齡CR干預(yù)的小鼠模型，并設(shè)立同齡自由攝食(ad libitum，AL)組作為對照。
　　2.通過對各年齡段AL和

6、CR組小鼠進(jìn)行Morris水迷宮(Morris Water Maze，MWM)實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)(Open Field Test，OFT)評價(jià)其認(rèn)知功能;
　　3.通過對各年齡段AL和CR組小鼠海馬組織蛋白的Western blot和海馬石蠟切片的免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)評價(jià)相關(guān)信號通路活性;
　　4.采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　研究結(jié)果:
　　1.通過OFT和MWM實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，3月齡前

7、CR干預(yù)阻礙小鼠認(rèn)知功能發(fā)育，但3月齡后開始CR干預(yù)延緩小鼠認(rèn)知功能的增齡性下降。
　　2.AL1.5m和AL3m小鼠海馬mTOR及其上游信號通路活性均分別顯著高于AL12m和AL20m組;CR在各年齡段均抑制mTOR及其上游信號通路活性。
　　3.LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值以及beclin1蛋白表達(dá)水平AL1.5m和AL3m組均顯著高于AL12m和AL20m組(p＜0.01)，AL12m組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值亦顯著高于AL2

8、0m組(p＜0.05);p62以及蛋白泛素化水平AL1.5m和AL3m組均顯著低于AL12m和AL20m組;CR顯著提高除1.5月齡外其他年齡小鼠海馬LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值以及顯著提高12和20月齡小鼠海馬beclin1表達(dá)水平(p＜0.05)，CR顯著抑制各個(gè)年齡段小鼠海馬p62表達(dá)水平以及12和20月齡小鼠蛋白泛素化水平(p＜0.05）。
　　4.AL1.5m和AL3m組小鼠SIRT1和FOXO1的表達(dá)均顯著高于AL12m和A

9、L20m組(p＜0.01)。CR分別顯著提高了12和20月齡組小鼠SIRT1和FOXO1的表達(dá)(p＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.CR抑制幼年小鼠海馬mTOR及其上游信號通路活性，同時(shí)抑制其認(rèn)知功能，提示mTOR信號通路對認(rèn)知功能發(fā)育的重要性;CR雖抑制成年后小鼠海馬mTOR及其上游信號通路活性，但卻延緩其認(rèn)知功能的增齡性下降，提示神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育成熟后通過CR有效降低mTOR信號通路活性可能對緩解由于mTOR過度激活導(dǎo)