煙酸對(duì)小鼠腹腔巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種脂代謝紊亂及慢性炎癥性疾病，嚴(yán)重危害人類健康。目前AS發(fā)病率仍然很高，據(jù)WHO預(yù)測(cè)，到2050年，全球?qū)⒂腥种坏乃劳鲇梢訟S為病理基礎(chǔ)的心腦血管疾病引起。 AS最早期肉眼可見的損傷是脂質(zhì)條紋，主要由攝取了大量膽固醇的巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞構(gòu)成。血液循環(huán)中的單核細(xì)胞在動(dòng)脈易損部位黏附到活性內(nèi)皮細(xì)胞，并進(jìn)一步分化為巨噬細(xì)胞。此時(shí)巨噬細(xì)胞上表達(dá)大量的清道夫受體，并通過該類受體介

2、導(dǎo)的胞吞作用吞噬脂質(zhì)(包括膽固醇以及脂質(zhì)過氧化物)。巨噬細(xì)胞大量蓄積脂質(zhì)并逐漸轉(zhuǎn)變成富含膽固醇的巨噬泡沫細(xì)胞。巨噬泡沫細(xì)胞形成后不斷堆積，形成動(dòng)脈壁脂肪條紋，伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞增生和內(nèi)膜基底層平滑肌細(xì)胞的移行和增生，則逐漸構(gòu)成了動(dòng)脈粥樣斑塊早期損傷和脂質(zhì)條紋的主體。 抑制巨噬泡沫細(xì)胞的形成或者促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流是減少巨噬泡沫細(xì)胞的主要措施。膽固醇從巨噬細(xì)胞的流出是體內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的啟動(dòng)環(huán)節(jié)。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse

3、cholesterol transport，RCT)是外周細(xì)胞膽固醇通過高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟轉(zhuǎn)化、清除的重要生理過程。巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出對(duì)維持細(xì)胞膽固醇的平衡，促進(jìn)膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)及抗動(dòng)脈粥樣硬化都起著非常重要的作用。因此減少巨噬細(xì)胞內(nèi)的膽固醇的聚積，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流，讓泡沫化過程逆轉(zhuǎn)目前已經(jīng)成為AS預(yù)防與治療的新的途徑。 在對(duì)AS的研究中，煙酸的抗AS效應(yīng)一

4、直是關(guān)注的焦點(diǎn)。煙酸又稱尼克酸、維生素PP，是B族維生素大家族中的一員。早在1955年，Altshul和Hoffer就開始將煙酸作為一種調(diào)脂藥物。目前，煙酸已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床調(diào)節(jié)血脂異常，包括降低總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL—C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL—C)、甘油三脂(TG)、載脂蛋白B(apoB)；同時(shí)，能夠有效的升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL—C)。最新研究發(fā)現(xiàn)煙酸還表現(xiàn)出抗炎，抗氧化及改善血管內(nèi)皮等對(duì)AS

5、有益的作用。大規(guī)模的臨床實(shí)驗(yàn)也證實(shí)其能預(yù)防心血管疾病及降低病死率?？梢钥闯觯瑹熕嵊泻軓?qiáng)的抗AS效應(yīng)。 特別值得一提的是，煙酸是目前最有效的升高HDL的調(diào)脂藥，但其機(jī)制一直未完全闡明。研究表明HDL對(duì)AS的保護(hù)作用的機(jī)制之一就是因?yàn)镽CT。流行病學(xué)和體外研究發(fā)現(xiàn)，煙酸能選擇性的升高LPA—I(只含apoA—I的HDL)達(dá)24％，并呈劑量依賴性關(guān)系，同時(shí)抑制了肝臟對(duì)LPA—I的攝取，從而引起LPA—I在循環(huán)中的貯留，后者在RCT中是

6、膽固醇酯的一個(gè)很好的供體。這提示煙酸在膽固醇外流和RCT中可能起到很重要的調(diào)節(jié)作用。為了明確煙酸對(duì)膽固醇外流和RCT的調(diào)控作用，我們用小鼠腹腔巨噬泡沫細(xì)胞為研究模型，探討煙酸對(duì)膽固醇外流的影響及核受體調(diào)控機(jī)制，這些體外資料將為煙酸升高HDL機(jī)制研究以及深入研究煙酸抗AS效應(yīng)提供依據(jù)。 研究目的: 1.研究煙酸對(duì)小鼠腹腔巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流的影響2.探討煙酸影響膽固醇外流的可能核受體調(diào)控機(jī)制研究. 方法:

7、 1.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)和巨噬泡沫細(xì)胞模型的建立NIH小鼠頸椎脫臼處死，PBS注入小鼠腹腔，輕柔小鼠腹部，無菌吸管吸出腹腔內(nèi)PBS，收集于離心管中。4℃，3000rpm，離心10min。重復(fù)洗三次；離心后所得細(xì)胞重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基中，以2X106個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種到12孔板。置于CO2培養(yǎng)箱中37℃，5％CO2，孵育三小時(shí)后洗去未貼壁細(xì)胞。 密度梯度離心法提取血漿中的LDL，硫酸銅對(duì)其氧化修飾成oxLDL

8、。每孔加入濃度為50μg/ml的oxLDL，孵育24h轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘膳菽?xì)胞。 2.煙酸對(duì)巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流的影響將巨噬泡沫細(xì)胞分別與0.25mM、0.5mM和1mM煙酸培養(yǎng)24h，或者與1mM煙酸分別培養(yǎng)0h、12h、24h、36h，再與10μg/mlapoAI孵育24h，酶法檢測(cè)細(xì)胞和培養(yǎng)液中膽固醇的含量。 將[3H]負(fù)載的巨噬泡沫細(xì)胞分別與0.25mM、0.5mM和1mM煙酸培養(yǎng)24h，再與10μg/mlapoAI

9、孵育24h，檢測(cè)培養(yǎng)液中膽固醇的含量。 3.煙酸對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響將巨噬細(xì)胞分別與0.25mM、0.5mM和1mM煙酸孵育2h后，加入50μg/ml的oxLDL培養(yǎng)24h，檢測(cè)細(xì)胞和培養(yǎng)液中膽固醇的含量。 4.煙酸對(duì)巨噬細(xì)胞ABCA1、ABCG1、LXRα、PPARγmRNA表達(dá)影響將巨噬泡沫細(xì)胞分別與0.25mM、0.5mM和1mM煙酸培養(yǎng)24h，提取總RNA，熒光定量PCR法檢測(cè)ABCA1、ABCG1、

10、LXRα、PPARγmRNA表達(dá)5.放線菌素D或DIDS對(duì)膽固醇外流、ABCA1、ABCG1表達(dá)的影響用5μg/ml轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D與1mM煙酸共同培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h。檢測(cè)膽固醇的外流及ABCA1、ABCG1的表達(dá)；400μMABCA1的特異性阻斷劑DIDS與1mM煙酸共同培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h。檢測(cè)膽固醇的外流。 6.GGPP和GW9662對(duì)ABCA1表達(dá)和膽固醇的外流的影響將10μMLXRα的抑制劑GGPP或PPAR

11、γ抑制劑GW9662與1mM煙酸共同培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h。檢測(cè)膽固醇的外流及ABCA1、ABCG1的表達(dá)。 7.GW9662對(duì)LXRα表達(dá)影響將10μMPPARγ，抑制劑GW9662與1mM共同培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h，檢測(cè)LXRα表達(dá)。 研究結(jié)果: 1.煙酸促進(jìn)巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流與對(duì)照組相比，0.25mM、0.5mM和1mM煙酸培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h后，均能促進(jìn)膽固醇(包括總膽固醇、游離膽固醇)外流(p<0

12、.01或p<0.001)?？偰懝檀纪饬髀史謩e為對(duì)照組的1.4倍、1.7倍和2.1倍，游離膽固醇外流率分別為對(duì)照組的1.5倍、1.8倍和2.3倍，呈明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。 與0h相比，1mM煙酸培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞12h、24h、36h后，均能促進(jìn)膽固醇(包括總膽固醇、游離膽固醇)外流(p<0.01)，且在24h時(shí)膽固醇的外流達(dá)到最大，這一作用存在明顯的時(shí)間—效應(yīng)關(guān)系。 與對(duì)照組相比，0.25mM、0.5mM和1mM煙酸均能夠

13、促進(jìn)巨噬泡沫細(xì)胞[3H]膽固醇的外流，外流率分別為對(duì)照組的1.5倍、2.1倍和3.2倍，差異具有顯著性(p<0.01或p<0.001)。 2.煙酸對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響巨噬細(xì)胞與0.25mM、0.5mM和1mM煙酸培養(yǎng)24h后，與對(duì)照組相比，oxLDL組細(xì)胞總膽固醇和游離膽固醇增加(p<0.05)；與oxLDL組相比，不同濃度煙酸組細(xì)胞總膽固醇和游離膽固醇沒有差別(p>0.05)，但有減少的趨勢(shì)。 3.煙酸促進(jìn)巨噬泡沫

14、細(xì)胞ABCA1、ABCG1的表達(dá)與對(duì)照組相比，0.25mM、0.5mM、1mM煙酸能夠促進(jìn)巨噬泡沫細(xì)胞ABCA1、ABCG1mRNA的表達(dá)，ABCA1的表達(dá)分別是對(duì)照組的3.7倍、18.1倍和34.4倍；ABCG1的表達(dá)分別是對(duì)照組的4.7倍、12.7倍和21.1倍，差異具有顯著性(p<0.01或p<0.001)，這一作用存在明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。 4.放線菌素D或DIDS阻斷ABCA1、ABCG1mRNA及膽固醇外流的表達(dá)用5

15、μg/ml放線菌素D或400μMDIDS與分別1mM煙酸共同培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h后，煙酸誘導(dǎo)巨噬泡沫細(xì)胞ABCA1、ABCG1mRNA明顯降低，與對(duì)照組相比，差異具有顯著性(p<0.001)。放線菌素D和DIDS還能抑制煙酸誘導(dǎo)的膽固醇外流，與對(duì)照組相比，差異具有顯著性(p<0.001)。 5.煙酸促進(jìn)巨噬泡沫細(xì)胞LXRα、PPARγmRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比，0.25mM、0.5mM、1mM煙酸能夠促進(jìn)巨噬泡沫細(xì)胞LXRα、

16、PPARγmRNA的表達(dá)，LXRα的表達(dá)分別是對(duì)照組的7.8倍、26.1倍和51.4倍；PPARγ的表達(dá)分別是對(duì)照組的9.7倍、41.1倍和75.3倍，差異具有顯著性(p<0.05，p<0.01或p<0.001)，這一作用存在明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。 6.GGPP和GW9662阻斷ABCA1、ABCG1mRNA的表達(dá)和膽固醇的外流用10μMGGPP或GW9662與分別1mM煙酸共同培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h后，煙酸誘導(dǎo)巨噬泡沫ABCA

17、1、ABCG1mRNA明顯降低，與煙酸組相比，差異具有顯著性(p<0.001)。GGPP和GW9662還能抑制煙酸誘導(dǎo)的膽固醇外流，與對(duì)照組相比，差異具有顯著性(p<0.001)。 7.GW9662阻斷LXRαmRNA的表達(dá)用10μMPPARγ抑制劑GW9662與1mM煙酸共同培養(yǎng)巨噬泡沫細(xì)胞24h后，煙酸誘導(dǎo)的LXRαmRNA明顯降低，與煙酸組相比，差異具有顯著性(p<0.001)。 結(jié)論: 1.煙酸能夠顯著促