槲皮素對體外培養(yǎng)肝細(xì)胞膽固醇合成及外流的影響.pdf

1、目的：探討植物化學(xué)物質(zhì)槲皮素(Quercetin)對脂肪變性人肝L-02細(xì)胞脂滴形成、膽固醇合成限速酶HMG-CoA還原酶和三磷酸腺苷結(jié)合框轉(zhuǎn)運(yùn)子A1、 G5、 G8等膽固醇外流途徑主要相關(guān)基因表達(dá)的作用及細(xì)胞內(nèi)膽固醇、膽固醇酯含量的影響，了解槲皮素對肝細(xì)胞膽固醇合成及轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，并探討其作用機(jī)制。 方法：取正常人肝L-02細(xì)胞，和經(jīng)50％胎牛血清造模24小時建立的脂肪變性肝細(xì)胞模型，共同作為研究對象。實(shí)驗(yàn)分為8組：第一組為空白

2、對照，即正常肝細(xì)胞組；第二組為脂肪變性肝細(xì)胞組；第三組至第六組在脂變細(xì)胞中分別加入不同劑量槲皮素，使槲皮素終濃度分別為10 μmol/L、 20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L；第七組為藥物對照組，即脂肪變性肝細(xì)胞加入普羅布考，使其終濃度為10 μmol/L；第八組為正常肝細(xì)胞加20 μmol/L槲皮素對照組。每組加藥后繼續(xù)孵育24小時。用MTT法觀察槲皮素對脂肪變性人肝L-02細(xì)胞模型增殖的影響；油紅O染色觀察每

3、組細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成情況；高效液相色譜法（HPLC）檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇（TC）、游離膽固醇（FC）和膽固醇酯(CE)的含量，并計算細(xì)胞內(nèi)CE/TC比值及培養(yǎng)基FC含量；RT-PCR 法檢測每組肝細(xì)胞HMG-CoA還原酶及ABCA1 、ABCG5 、ABCG8 mRNA水平的表達(dá)；從而確定槲皮素降低細(xì)胞CE的最佳濃度，作出量效關(guān)系。然后以槲皮素的最佳濃度處理細(xì)胞不同的時間，即6小時、12小時、24小時、48小時，再分別檢測各組細(xì)胞HMG-Co

4、A還原酶和ABCA1 、ABCG5 、ABCG8mRNA水平的表達(dá)，高效液相色譜法檢測細(xì)胞膽固醇含量，確定槲皮素降低細(xì)胞CE的最佳時間，作出時效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P﹤0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果：經(jīng)50％胎牛血清孵育24小時后，倒置顯微鏡下可觀察到L－02細(xì)胞脂肪變性，胞漿內(nèi)充滿大量可被油紅O紅染的脂滴，且高效液相色譜法檢測細(xì)胞內(nèi)外膽固醇含量均明顯增加（P﹤0.05）

5、,示脂變肝細(xì)胞模型成功建立。經(jīng)不同濃度的槲皮素（10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）處理脂肪變性肝細(xì)胞24小時，結(jié)果顯示：槲皮素對脂肪變性人肝L-02細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，油紅O染色表明，細(xì)胞內(nèi)脂滴較處理前減少。槲皮素呈濃度依賴性的降低脂變肝細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)TC、CE，增加培養(yǎng)基中FC含量，同時呈濃度依賴性的減少HMG-CoA還原酶的表達(dá)、增加ABCA1 、ABCG5 、ABCG8mRNA的表達(dá)。

6、將40 μmol/L的槲皮素與脂肪變性肝細(xì)胞共同處理6，12，24，48小時,結(jié)果顯示：細(xì)胞內(nèi)脂滴呈時間依賴性減少；槲皮素呈時間依賴性的降低脂變細(xì)胞內(nèi)TC、CE，增加培養(yǎng)基中FC含量，同時呈時間依賴性的減少HMG-CoA還原酶的表達(dá)、增加ABCA1 、ABCG5 、ABCG8mRNA的表達(dá)。 結(jié)論：1、脂肪變性人肝L-02肝細(xì)胞中總膽固醇及膽固醇酯的含量均增加；2、槲皮素能降低脂變?nèi)烁蜭-02細(xì)胞總膽固醇及膽固醇酯含量，增加游離