PPARγ對(duì)炎癥狀態(tài)下C57小鼠腹腔巨噬細(xì)胞膽固醇外流的影響.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是許多臨床心血管疾病的病理基礎(chǔ)，是多因素參與、多基因調(diào)控的復(fù)雜病理過(guò)程。細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡失調(diào)、膽固醇代謝障礙導(dǎo)致的泡沫細(xì)胞形成是AS最主要的病理特征。巨噬細(xì)胞作為泡沫細(xì)胞的來(lái)源細(xì)胞之一，其膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(膽固醇外流)功能是維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡及影響泡沫細(xì)胞形成的重要環(huán)節(jié)，這一過(guò)程受多個(gè)信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated recepto

2、rs gamma，PPARγ)屬核受體超家族成員，作用非常廣泛，除參與脂質(zhì)代謝、糖代謝平衡外，還涉及脂肪細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞的分化。 近年的研究顯示：PPARγ及其配體對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇外流也有重要作用，Chawla等首次將PPARγ、LXRα及ABCA1三者有機(jī)的聯(lián)系在一起，提出了膽固醇外流的PPARγ-LXRα-ABCA1途徑，認(rèn)為PPARγ及其配體能通過(guò)這一途徑明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇外流。除此之外，PPARγ還可以

3、通過(guò)反式阻抑機(jī)制負(fù)性調(diào)控巨噬細(xì)胞炎性基因的表達(dá)，明顯抑制炎性反應(yīng)。有關(guān)PPARγ抗炎作用研究發(fā)現(xiàn)：PPARγ激動(dòng)劑能明顯抑制炎性刺激誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子(TNFα、IL-1、IL-6、NO)；PPARγ配體預(yù)處理野生型動(dòng)物，能明顯降低組織內(nèi)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕炎癥局部和遠(yuǎn)隔部位的組織損傷，對(duì)多種實(shí)驗(yàn)性炎性疾病，如急性心肌炎、自身免疫性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化等均顯示較好的治療作用。 目前的研究已將動(dòng)脈粥樣硬化歸結(jié)為

4、脂代謝紊亂及慢性炎性損害綜合作用的結(jié)果。因而在促進(jìn)AS形成的重要因素炎癥環(huán)境下，弄清PPARγ扮演何種角色以及對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇外流究竟產(chǎn)生何種影響和影響程度是非常有意義的，將有助于進(jìn)一步揭示泡沫細(xì)胞的成因并對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化開拓新的思路。基于此，本研究將PPARγ視作巨噬細(xì)胞調(diào)控膽固醇外流與炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的“交匯點(diǎn)”，從體內(nèi)和體外兩個(gè)層面來(lái)觀察炎癥對(duì)C57小鼠腹腔巨噬細(xì)胞膽固醇外流的影響并探討PPARe在其中的作用。首先建立包括高脂，

5、急性炎癥等不同病理狀態(tài)的C57小鼠模型并分離培養(yǎng)其腹腔巨噬細(xì)胞，觀察細(xì)胞PPARγ，IкB-α表達(dá)變化，明確各組細(xì)胞膽固醇外流變化規(guī)律；然后采用PPARγ激動(dòng)劑ciglitazone和PPARγ反義寡核苷酸預(yù)處理正常C57小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，體外觀察內(nèi)毒素刺激對(duì)細(xì)胞膽固醇外流的影響，初步探討炎癥條件下C57小鼠腹腔巨噬細(xì)胞膽固醇外流的變化以及PPARγ在維持巨噬細(xì)胞膽固醇外流與抗炎反應(yīng)動(dòng)態(tài)平衡中的作用。 主要結(jié)果如下： 1

6、．高脂飲食組小鼠血脂水平(總膽固醇、總甘油三酯，4.17±0.68、3.47±0.59)明顯高于正常飲食組(1.71±0.33、1.21±0.29，P<0.05)，兩種飲食小鼠分別用內(nèi)毒素刺激后血脂水平無(wú)明顯差異(P>0.05)；正常及高脂飲食組小鼠經(jīng)LPS刺激后血漿TNFα水平(7.09±1.95、6.64±1.39)較正常飲食組(2.09±0.37，P<0.01)顯著升高，高脂飲食組(3.89±0.57)較正常飲食組(2.09±0.

7、37，P<0.05)升高。 2．油紅O染色可見兩組高脂飲食小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴增加；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：正常及高脂飲食組細(xì)胞PPARγ無(wú)表達(dá)，LPS刺激后兩組細(xì)胞表達(dá)均輕度升高；正常飲食組NF-кB無(wú)表達(dá)，高脂飲食組輕度升高，LPS刺激后兩組細(xì)胞表達(dá)均明顯增強(qiáng)。 3．Western-blotting檢測(cè)結(jié)果顯示：高脂飲食組和兩個(gè)LPS組PPARγ蛋白表達(dá)(OD值分別為1.97±0.31、3.19±1.21、3.27±

8、0.88)較正常對(duì)照組(1.00，P<0.05)均明顯增高；高脂飲食組IкB-α表達(dá)(OD值0.88±0.19)較正常組(1.00，P>0.05)輕度降低，兩種飲食經(jīng)LPS刺激后IкB-α表達(dá)(OD值分別為0.49±0.07、0.44±0.11)較正常組(1.00，P<0.01)均顯著降低。 4．RT-PCR結(jié)果顯示：高脂飲食組及高脂加LPS組PPARγmRNA表達(dá)(相對(duì)灰度值分別為0.67±0.18、0.75±0.22)均較正

9、常飲食組(0.39±0.11，P<0.05)顯著增強(qiáng)，正常加LPS組PPARγmRNA表達(dá)(相對(duì)灰度值為0.47±0.13)與正常飲食組(0.39±0.11，P>0.05)相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 5．膽固醇外流測(cè)定結(jié)果顯示：高脂飲食組細(xì)胞膽固醇外流(37％)較正常對(duì)照組(25％，P<0.05)明顯增強(qiáng)，高脂及正常飲食經(jīng)LPS刺激后(18％、14％)較正常對(duì)照組(25％，P<0.05)均明顯減弱，兩組間無(wú)差異。 6．PPAR

10、γ激動(dòng)劑ciglitazone預(yù)處理正常C57小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，LPS刺激后PPARγ蛋白和mRNA表達(dá)(2.65±0.73、0.81±0.25)較正常對(duì)照組(1.00、0.42±0.12，P<0.05)升高，IкB-α蛋白表達(dá)(0.81±0.12)低于正常組(1.00，P>0.05)。細(xì)胞膽固醇外流受到抑制，但抑制程度(11.37％)小于正常對(duì)照組(25.72％)。 7．PPARγ反義寡核苷酸預(yù)處理正常C57d小鼠腹腔巨噬細(xì)胞

11、，LPS刺激后PPARγ蛋白和mRNA表達(dá)(0.31±0.11、0.17±0.08)較正常對(duì)照組降低(1.00、0.42±0.12，P<0.05)，IкB-α蛋白表達(dá)(0.29±0.08)明顯低于正常組(1.00，P<0.01)。細(xì)胞膽固醇外流受到抑制，但抑制程度(47.82％)高于正常對(duì)照組(25.72％)。 結(jié)論： 1.LPS刺激增強(qiáng)C57小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PPARγ表達(dá)。 2.LPS刺激抑制C57小鼠腹腔巨噬