阿托伐他汀在炎癥狀態(tài)下對(duì)ApoE---小鼠肝臟的影響及其可能機(jī)制研究.pdf

1、目的：高膽固醇血癥是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素，他汀類藥物不僅有效降低血中低密度脂蛋白膽固醇水平，而且顯著減少心血管疾病的發(fā)病率和死亡率，被廣泛用于心血管疾病的一、二級(jí)預(yù)防中。阿托伐他汀是其中應(yīng)用最多的一種他汀類藥物。肝損傷是他汀最常見的不良反應(yīng)之一，但其發(fā)病的危險(xiǎn)因素和機(jī)制尚不完全清楚。炎癥應(yīng)激是藥物誘導(dǎo)性肝損傷的易感因素，然而并不清楚它是否可增加他汀誘導(dǎo)肝損傷的敏感性。此外，藥物誘導(dǎo)性肝損傷的發(fā)生依賴于藥物對(duì)肝臟的損傷與肝臟適應(yīng)性自我

2、保護(hù)之間的失衡。有報(bào)道許多藥物包括他汀可誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），引起氧化應(yīng)激損傷。另一方面，核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2，調(diào)節(jié)大多數(shù)抗氧化酶基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子）的激活可保護(hù)肝臟免受藥物誘導(dǎo)的損傷，這兩者的失衡是否可解釋他汀誘導(dǎo)的肝損傷目前也不清楚。本課題旨在研究炎癥狀態(tài)下阿托伐他汀對(duì)ApoE-/-小鼠肝臟的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。
　　方法：西方飲食喂養(yǎng)雄性ApoE-/-小鼠建立高膽固醇血癥模型，酪蛋白隔

3、日皮下注射小鼠建立慢性炎癥模型。ApoE-/-小鼠被隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（0.9％生理鹽水0.5ml隔日皮下注射）；阿托伐他汀組（0.9%生理鹽水0.5ml隔日皮下注射+阿托伐他汀10mg/kg/d口服）；酪蛋白注射組（10%酪蛋白0.5ml隔日皮下注射）；酪蛋白注射聯(lián)合阿托伐他汀治療組（10%酪蛋白0.5ml隔日皮下注射+阿托伐他汀10mg/kg/d口服），建模時(shí)間共8周。第一部分：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清炎癥因子（IL

4、6和TNFα）和游離脂肪酸（FFA）水平。檢測(cè)小鼠血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的水平。蘇木精-伊紅（HE）和油紅O染色了解肝臟脂肪變程度。酶偶聯(lián)比色法檢測(cè)肝組織甘油三酯（TG）含量；ELISA檢測(cè)肝臟游離脂肪酸（FFA）含量。RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)小鼠肝組織脂肪酸合酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白

5、1（SREBP1）的基因和蛋白表達(dá)。肝組織 F4/80免疫組化染色了解肝臟巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況。RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)小鼠肝組織白介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNFα）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP1）的基因和蛋白表達(dá)。天狼猩紅染色了解肝組織膠原沉積情況。RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)小鼠肝組織α平滑肌肌動(dòng)蛋白（αSMA）、IV型膠原蛋白（Col IV）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ）的基因和蛋

6、白表達(dá)。第二部分：肝組織新鮮冰凍切片DHE染色了解超氧陰離子（O2-）的含量。比色法檢測(cè)小鼠肝組織過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）的含量。肝組織Nrf2免疫組化染色了解 Nrf2在肝細(xì)胞胞漿和胞核的分布和表達(dá)情況，Western blot進(jìn)一步檢測(cè)肝組織胞漿和胞核Nrf2的蛋白表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)Nrf2下游靶基因血紅素加氧酶-1（HO-1）、醌氧化還原酶1（NQO1）和超氧化物歧化酶2（SOD2）的基因表達(dá)。酶比色法檢測(cè)小鼠肝

7、組織過氧化氫酶（CAT）和總超氧化物歧化酶（SOD）的活性。
　　結(jié)果：第一部分：酪蛋白皮下注射的小鼠血清IL6和TNFα水平明顯高于對(duì)照組（P<0.05），提示炎癥模型成功建立。無論在非炎癥還是炎癥狀態(tài)下，阿托伐他汀均明顯降低小鼠血清 TC和 LDL-C水平（P<0.05），但對(duì)血清TG和FFA無明顯影響。炎癥狀態(tài)下，阿托伐他汀明顯升高血清ALT和AST水平（P<0.05），加重肝臟脂質(zhì)沉積，明顯增加肝臟TG和FFA含量（P<0

8、.05），并上調(diào)FAS、ACC和SREBP1的基因、蛋白表達(dá)（P<0.05）；同時(shí)增加肝組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，上調(diào)IL1β、TNFα和MCP1的基因、蛋白表達(dá)（P<0.05）；此外，阿托伐他汀還促進(jìn)肝臟膠原沉積，增加α SMA、ColIV和 TGFβ的基因、蛋白表達(dá)（P<0.05）。但在非炎癥狀態(tài)下，阿托伐他汀對(duì)血清ALT和AST水平無明顯影響，且不加重肝臟脂肪變、炎癥和纖維化程度。第二部分：非炎癥狀態(tài)下，阿托伐他汀治療的小鼠肝臟O2-、H

9、2O2和MDA的含量較對(duì)照組無明顯變化，但肝細(xì)胞胞漿、胞核Nrf2的蛋白表達(dá)及其下游靶基因的mRNA表達(dá)均明顯增加（P<0.05），肝臟CAT、SOD的活性也明顯增強(qiáng)（P<0.05）。與之相反的是，炎癥狀態(tài)下阿托伐他汀治療的小鼠肝臟O2-、H2O2和MDA的含量明顯增加（P<0.05），但肝臟Nrf2的蛋白表達(dá)，Nrf2下游靶基因mRNA的表達(dá)以及CAT、SOD的活性均無明顯變化。
　　結(jié)論：1、非炎癥狀態(tài)下，阿托伐他汀對(duì) Apo