ApoE---小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中EMMPRIN和uPA的表達(dá)及阿托伐他汀干預(yù)的研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是心血管疾病患者發(fā)生心臟事件的主要原因，其發(fā)生的主要機(jī)制為不穩(wěn)定斑塊(Vulnerable plaque)的破裂并繼發(fā)血栓，從而導(dǎo)致急性的血流減少或中斷。不穩(wěn)定性斑塊的主要病理特征為：薄的偏心性纖維帽，富含脂質(zhì)的粥樣壞死中心，斑塊周圍大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。既往研究證實(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶(metalloproteinases，MMPs)能降解

2、纖維帽基質(zhì)，使斑塊失去穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致斑塊破裂。MMPs是影響易損斑塊薄纖維帽的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)降解過(guò)程的關(guān)鍵因子。由于MMPs在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，并起到降解細(xì)胞外基質(zhì)作用，被證實(shí)與動(dòng)脈粥樣硬化、ACS發(fā)生有著密不可分的聯(lián)系。隨著研究深入，作為誘導(dǎo)MMPs產(chǎn)生及分泌的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloprotei

3、nase inducer，EMMPRIN)被證實(shí)在人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的血管內(nèi)膜、血管平滑肌細(xì)胞以及斑塊內(nèi)高表達(dá)。動(dòng)脈粥樣硬化患者的旋切斑塊染色表明，在斑塊易破裂的肩部及巨噬細(xì)胞大量浸潤(rùn)處有EMMPRIN的表達(dá)。不僅如此，還有研究發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN在急性心肌梗死患者體內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)，它刺激單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表達(dá)MMP-9、平滑肌細(xì)胞表達(dá)MMP-2，而在穩(wěn)定型心絞痛患者體內(nèi)無(wú)過(guò)表達(dá)。諸多研究證實(shí)MMPs及其上游因子-EMMPRIN在促進(jìn)基質(zhì)的

4、降解、導(dǎo)致ACS的發(fā)生等方面同樣起著極其重要的作用。尿激酶型纖溶酶原激活物(Urokinase-typeplasminogen activator，uPA)是纖溶酶原系統(tǒng)的重要組成部分，其致動(dòng)脈粥樣硬化的作用正得到新的認(rèn)識(shí)：在動(dòng)脈壁局部起到促使基質(zhì)降解、細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移增殖、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)等作用。還可在多種細(xì)胞因子的刺激下直接參與到動(dòng)脈粥樣硬化的血管重塑過(guò)程中。Quemener在研究腫瘤細(xì)胞的侵襲性過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN通過(guò)刺激MM

5、P2、MMP9、uPA的表達(dá)提高了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。在這個(gè)研究中，EMMPRIN的過(guò)表達(dá)刺激了uPA的分泌，MMP2、MMP9的作用與其參與新生血管的形成有關(guān)。Joachim Kienast發(fā)現(xiàn)：人冠狀動(dòng)脈內(nèi)uPA的含量與粥樣硬化病變的存在和嚴(yán)重性相關(guān)。且有研究發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN和uPA在冠心病患者的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中及斑塊破裂的好發(fā)部位“肩部”均有高表達(dá)。還有研究證明uPA與MMPs均受到EGF/EGFR系統(tǒng)的調(diào)控，uPA可通過(guò)誘

6、導(dǎo)MMPs的表達(dá)起到水解ECM的作用。那么，在人動(dòng)脈粥樣硬化病變過(guò)程中，EMMRPIN、uPA兩者存在什么樣的關(guān)系，uPA是否也通過(guò)MMPs這一途徑致動(dòng)脈粥樣硬化并起到粥樣斑塊去穩(wěn)定的作用，抑或EMMRPIN通過(guò)調(diào)節(jié)uPA表達(dá)的作用參與到動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展中。
　　 多項(xiàng)大型臨床試驗(yàn)證實(shí)應(yīng)用他汀類藥物可明顯減少穩(wěn)定性心絞痛及ACS患者的心血管病死亡率及全因死亡率，且不全依賴于血漿膽固醇的降低，但其中的相關(guān)機(jī)制目前尚不完全

7、清楚。阿托伐他汀(atorvastatin)是羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，作為代表性的他汀類藥物，除具有調(diào)脂作用外，亦被認(rèn)為具有抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、穩(wěn)定內(nèi)皮功能、穩(wěn)定斑塊、促進(jìn)凋亡、抑制平滑肌細(xì)胞的增生、抑制血小板的凝集等不依賴于膽固醇降低的直接和間接心血管保護(hù)作用。WOSCOPS(西蘇格蘭冠心病預(yù)防研究)、AFCAPS/TexCAPS試驗(yàn)(空軍/得克薩斯州冠狀動(dòng)脈粥樣硬化研究)、ASCOT LLA、4S

8、(北歐辛伐他汀生存研究)、CARE(冠心病事件復(fù)發(fā)研究)、LIPID(普伐他汀對(duì)冠心病的長(zhǎng)期干預(yù))等大型國(guó)際臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明他汀類藥物的使用可使致命性和非致命性心肌梗死發(fā)病率降低，心血管事件減少，總病死率降低，血管重建/CABG需求減少。
　　 本實(shí)驗(yàn)以所形成病變與人類動(dòng)脈粥樣硬化病理學(xué)形態(tài)極為相似的載脂蛋白E基因敲除小鼠高脂飲食飼養(yǎng)建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，在體探討EMMPRIN與uPA在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)情況及阿托伐他汀干

9、預(yù)對(duì)其表達(dá)的調(diào)節(jié)作用：1、EMMPRIN與uPA是否在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中共同高表達(dá)；2、EMMPRIN與uPA的表達(dá)是否與斑塊的不穩(wěn)定性相關(guān)，在不同的階段的斑塊中表達(dá)是否存在區(qū)別；3、阿托伐他汀的應(yīng)用是否對(duì)EMMPRIN與uPA的表達(dá)存在影響，與時(shí)間及劑量是否相關(guān)。從而為動(dòng)脈粥樣硬化病變及ACS的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究提供理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、8周齡雄性ApoE-/-小鼠62只，平均體重24g，普通飼料適應(yīng)性

10、喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽出6只用作備用，按照普通小鼠飼料+15％豬油+1.25%膽固醇比例配制高脂飲食飼料，余下56只鼠隨機(jī)分為早期干預(yù)(ES)組(n=28)及晚期干預(yù)(LS)組(n=28)分別飼養(yǎng)6周及10周建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。隨后均使用阿托伐他汀藥物干預(yù)，早晚干預(yù)組各隨機(jī)分為4組(n=7)，分別為普通飲食對(duì)照組(A，E)，高脂飲食對(duì)照組(B，F(xiàn))，低劑量干預(yù)組(5mg/kg.d)(C，G)，高劑量干預(yù)組(10mg/kg.d)(D，H)；

11、干預(yù)組用高低兩種劑量阿托伐他汀混懸液0.3ml/d灌胃，對(duì)照組用等量生理鹽水灌胃。藥物干預(yù)8周后處死小鼠，采集標(biāo)本。
　　 2、血脂檢測(cè)：ApoE-/-小鼠處死前取血清，Olympus Au2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。
　　 3、蘇木精-伊紅染色：取ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈制備石蠟切片，脫蠟后用蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化斑

12、塊形態(tài)。
　　 4、半定量RT-PCR：取ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈，液氮中研磨組織，RNAiso Plus提取總RNA，核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA濃度，兩步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為cDNA。所有引物均參照Gengbank提供的序列，由大連寶生物公司合成?；駿MMPRIN和uPA、β-actin進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物序列分別是：EMMPRIN：上游：5’-GCA GAG GAC ACA GGC ACT TAC-3’，下游：5’-ACA

13、GGC TCA GGA AGG AAG ATG-3’；uPA：上游：5’-CCC CAA GGT TTACTG ATG TGC TC-3’，下游：5’-GAA GTG TGA GAC CCT CGT GTA GA--3’：β-actin：上游：5’-AGA TTA CTG CTC TGG CTC CTA GC-3’，下游：5’-ACT CAT CGT ACT CCTGCT TGC T-3’。RT-PCR儀擴(kuò)增目的基因后用1.5%瓊脂糖凝

14、膠電泳，凝膠成像儀分析其圖像并測(cè)得灰度值，以EMMPRIN和uPA與β-actin光密度比值表示EMMPRIN與uPAmRNA的表達(dá)水平。
　　 5、實(shí)時(shí)定量RT-PCR：總RNA提取、cDNA合成同前，基因表達(dá)用SYBR Greenl熒光定量PCR進(jìn)行分析。
　　 6、蛋白提取和Western blot：取ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈，液氮中研磨后按1mg組織加入預(yù)冷的10ul裂解液(含終濃度為1mM的PMSF)裂解組織，

15、收集裂解的組織在4℃下，20000轉(zhuǎn)離心30min，使用BCA定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取40μg總蛋白樣品與上樣緩沖液，混勻后100℃煮5 min，在10%SDS-PAGE中行垂直電泳(80-100V，120min)，室溫50V×120min轉(zhuǎn)樣品至PVDF膜，6.0%脫脂奶粉在4℃下溫和振蕩封閉過(guò)夜。取出膜結(jié)合相應(yīng)的EMMPRIN和uPA抗體，濃度按說(shuō)明書配比；內(nèi)參anti-GAPDH，濃度為1:1000，室溫振蕩1h，4℃孵育過(guò)夜，

16、TBST洗膜后，結(jié)合相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗，濃度為1:2500)，室溫1h。用化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)盒與PVDF膜共孵育1min后，將PVDF膜與X光片放入暗盒內(nèi)曝光3min，顯影后定影。掃描膠片，用軟件分析條帶光密度值，以EMMPRIN和uPA與GAPDH條帶的吸光面積積分比值評(píng)定EMMPRIN與uPA蛋白表達(dá)水平。
　　 7.免疫組化及膠原細(xì)胞的檢測(cè)：免疫組化法使用抗體檢測(cè)巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞。步驟如下：切片脫蠟至水，0

17、.3％H2O2甲醇處理切片，蒸餾水、PBS清洗。枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)，取出迅速冷卻，PBS清洗洗。封閉后加入對(duì)應(yīng)一抗孵育。清洗后二抗孵育。PBS洗，蒸餾水洗。Harris蘇木素染核。蒸餾水洗，分化，藍(lán)化，脫水，透明并封固。于光鏡下觀察染色結(jié)果，結(jié)果用Image Pro Plus6.0分析軟件分析。Masson法檢測(cè)膠原成分，步驟為：切片脫蠟至水，0.3%H2O2甲醇處理切片，蒸餾水、PBS漂洗。Harris蘇木素染核，鹽酸酒精分化

18、。蒸餾水沖洗，麗春紅酸性品紅液染色，蒸餾水沖洗。1%磷鉬酸中染色，不洗，置于苯胺藍(lán)液或亮綠液。蒸餾水快速?zèng)_洗，60℃溫箱烘干，二甲苯透明，封固。于光鏡下觀察染色結(jié)果，結(jié)果用Image Pro Plus6.0分析軟件分析。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功建立動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型：ApoE-/-小鼠在高脂飲食(普通小鼠飼料+15%豬油+1.25%膽固醇)6周后，主動(dòng)脈大體標(biāo)本石蠟切片HE染色倒置相差纖維鏡下觀察小鼠主動(dòng)脈內(nèi)AS

19、斑塊形成。至10周，可見(jiàn)形成粥樣核心及纖維帽的顯著斑塊，斑塊內(nèi)大量泡沫細(xì)胞形成和堆積，主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，向管腔突出，模型建立成功。
　　 2、ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈石蠟切片HE染色倒置相差纖維鏡下觀察結(jié)果顯示，小鼠高脂飲食飼養(yǎng)6周時(shí)相比普通飲食喂養(yǎng)小鼠所形成斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞形成和堆積明顯增多，主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，并突向管腔，斑塊穩(wěn)定性差，較易損。隨高脂飲食喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，粥樣斑塊病變程度加重，斑塊不穩(wěn)定性增強(qiáng)，與普通飲食喂養(yǎng)小鼠相比

20、存在明顯差異，斑塊的形成早期且程度嚴(yán)重。
　　 3、ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈及粥樣硬化斑塊內(nèi)EMMPRIN與uPA基因及蛋白的表達(dá)：早/晚干預(yù)組高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈分別用RT-PCR、Real-Time PCR及Western blot、免疫組化方法從基因、蛋白及組織三個(gè)水平檢測(cè)EMMRPIN、uPA的表達(dá)。結(jié)果顯示高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠EMMPRIN與uPA的基因及蛋白的表達(dá)與普通喂養(yǎng)對(duì)照組相比明顯增加，差別均有

21、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，基因及蛋白的表達(dá)都做了內(nèi)對(duì)照)。
　　 4、阿托伐他汀干預(yù)可降低ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈及粥樣硬化斑塊中EMMPRIN與uPA的表達(dá)：對(duì)使用高脂飲食建立了動(dòng)脈粥樣硬化模型的小鼠，使用不同劑量的阿托伐他汀進(jìn)行干預(yù)，并分別用RT-PCR、Real-Time PCR及Western blot、免疫組化法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈及粥樣硬化斑塊內(nèi)EMMPRIN與uPA的基因、蛋白及組織水平的表達(dá)；結(jié)果顯示，阿托伐他汀干預(yù)后

22、主動(dòng)脈內(nèi)EMMPRIN與uPA的表達(dá)與高脂組相比顯著降低，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈及粥樣硬化斑塊中EMMPRIN與uPA表達(dá)上調(diào)，該現(xiàn)象可被阿托伐他汀所阻斷。
　　 5、阿托伐他汀通過(guò)劑量依賴降低ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈及粥樣硬化斑塊中EMMPRIN與uPA表達(dá)：分別使用高/低兩種劑量阿托伐他汀干預(yù)使用高脂飲食喂養(yǎng)建立動(dòng)脈粥樣硬化模型的小鼠，并分別用RT-PCR、Real-Tim

23、e PCR及Western blot、免疫組化法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈及粥樣硬化斑塊內(nèi)EMMPRIN和uPA基因及蛋白的表達(dá)；結(jié)果顯示，高劑量組主動(dòng)脈內(nèi)EMMPRIN與uPA的基因及蛋白的表達(dá)與低劑量組相比顯著降低，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈及粥樣硬化斑塊中EMMPRIN與uPA的表達(dá)上調(diào)可被阿托伐他汀所劑量依賴型阻斷。
　　 6.uPA與EMMPRIN在ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈及粥樣硬化斑塊中表達(dá)增高

24、且呈相同趨勢(shì)，使用阿托伐他汀干預(yù)后均出現(xiàn)表達(dá)的明顯下降且趨勢(shì)一致。
　　 結(jié)論:
　　 1.高脂飲食可誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)早期形成程度嚴(yán)重的粥樣硬化斑塊；
　　 2.ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中EMMPRIN與uPA出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，其程度與斑塊的嚴(yán)重程度及不穩(wěn)定性相關(guān)。
　　 3.他汀可一定程度減輕高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病變嚴(yán)重程度。
　　 4.他汀干